汽車尾氣染毒動物模型的構建及其對雄鼠生殖功能影響的初步研究

姚基偉，楊 偉，丁 杰，萬 凌，王浩宇，李前偉，李為兵，李川海，鄢俊安 (.重慶市人口和計劃生育科學技術研究院，重慶4047;.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍泌尿外科研究所，重慶400038)

環(huán)境是人類生存和發(fā)展的基礎，生殖健康是人類進化和繁衍的必要條件。然而近50 年來男性生殖健康水平逐年下降［1］，在眾多影響因素中，環(huán)境污染因素一直都是國際上研究的熱點［2］。汽車尾氣污染是環(huán)境污染的主要組成部分［3］，是引發(fā)霧霾天氣的罪魁禍首之一。隨著國家經濟的快速發(fā)展和城市化的推進，汽車的保有量持續(xù)上升［4］，由此帶來的汽車尾氣污染將會更加嚴重。國外研究表明，長期暴露于汽車尾氣中的特殊人群均可出現生殖健康受損［5］。汽車尾氣的生殖毒性及機制的研究國內報道較少，主要原因之一就是沒有較為可靠的尾氣染毒模型。因此，本實驗擬構建一套有效可行的汽車尾氣染毒裝置和方法，并運用其初步探討汽車尾氣對雄鼠生殖系統(tǒng)的影響，為相關分子機制的研究創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24 只清潔級雄性(SPF 級)C57BL/6 小鼠購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物中心，9 ～10 周齡，體質量23 ～25 g;提供充足飲食飲水，室溫(22 ±1)℃，光照與黑暗周期均為12 h(7 ∶00 ～19 ∶00)，汽車尾氣染毒時間為每天14 ∶00 ～20 ∶00。

1.2 染毒裝置

染毒裝置由發(fā)電機(伊藤動力)及其進氣口、小型風扇及其進氣口、排氣管、采樣口、和自制玻璃染毒柜5 個部分構成。發(fā)電機產生汽車尾氣從進氣口進入染毒裝置內，小型風扇持續(xù)向染毒柜內通入空氣，排氣管實現染毒柜內的氣體與外界氣體進行交換，運用氧含量檢測儀(?，擜R8100)于采樣口檢測氧含量。

1.3 實驗方法

首先設計自制汽車尾氣染毒裝置(圖1a)，并根據設計構建染毒模型。將24 只C57BL/6 小鼠隨機分為尾氣暴露組和對照組，各12 只。尾氣暴露組放入染毒裝置內且持續(xù)向其通汽車尾氣4 min，間隔20 min 后再次通注尾氣;以此類推每天循環(huán)6 h 且持續(xù)40 d;對照組則暴露于正?？諝庵小Ｈ径窘Y束后用天平稱取2 組小鼠的體質量及睪丸、附睪尾的質量，記錄并比較各組質量。取附睪尾的精子制成精子懸液。利用計算機輔助精液分析技術來評估精子總數、總活動力和前向運動力［6］;取部分精子懸液加入4%多聚甲醛固定，吸取適量固定后的精子標本推片晾干用2%的伊紅染色2 h，清水沖洗干燥后計數完整精子(500 條/只)中的畸形精子數，并計算精子畸形率。心臟抽取血離心取上清;取0.1 g 睪丸組織并勻漿。按照活性氧(ROS)測定試劑盒的說明書進行血和睪丸ROS 含量進行檢測。

1.4 統(tǒng)計方法

2 實驗結果

2.1 汽車尾氣染毒動物模型的構建

持續(xù)染毒裝置內(圖1b)通尾氣1 ～4 min 小鼠活動逐漸減弱或躁動，平均5 min 左右出現窒息死亡。故我們將通注尾氣時間保守地設定為4 min，此時染毒裝置內的氧氣含量為(17.33 ±0.09)%。4 min 后關閉發(fā)動機，關閉5 min、10 min 和15 min 后，染毒裝置內對應的氧氣含量分別為(19.80 ±0.17)%、(20.20 ± 0.06)% 和(20.53 ± 0.03)%，見 圖1c。15 min后氧氣含量與大氣中的含量相近，但裝置內尾氣的含量仍然較高;20 min 后裝置內尾氣的氣味較弱。因此，設定每次通氣的時間間隔為20 min。

圖1 汽車尾氣染毒裝置及染毒動物模型的構建

2.2 汽車尾氣暴露對生殖系統(tǒng)的影響

尾氣暴露組小鼠平均體質量和睪丸質量與對照組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)，但附睪質量較對照組明顯下降(P ＜0.01)，見表1。評估2 組小鼠精液質量時，在運用計算機輔助靜液分析技術檢測小鼠精液質量的過程中，其中4 個樣品(每組各2 只小鼠)由于所使用的培養(yǎng)基受到污染導致精子大量死亡，無法滿足實驗需求而排除。結果發(fā)現對照組小鼠精子數目、總活動力和前向活動力均明顯高于尾氣暴露組(P ＜0.01)，而精子畸形率低于尾氣暴露組(P ＜0.01)，見表2。

表1 小鼠體質量及生殖腺質量變化(n=12，g)

表2 2 組小鼠精液質量對比(n=10)

2.3 小鼠血和睪丸組織中ROS 的變化

實驗中由于每組各2 只小鼠的血液無法滿足ROS 檢測而被排除。因此本組結果中各組都只有10 個樣品。尾氣暴露組小鼠血ROS 為(952.692 ±7.35)U/mL，睪丸組織中的ROS 為(48.948 ± 1.294)U/mgogrot，均 明 顯 高 于 對 照 組 小 鼠 的(335.498 ±5.509)U/mL 和(20.746 ±0.649)U/mgogrot，2 組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)，表明汽車尾氣暴露可能增加血液和生殖系統(tǒng)活性氧含量。

3 討論

在各類環(huán)境污染中，汽車尾氣引發(fā)的大氣污染及其對人類健康的危害，逐漸被全世界視為研究的重點。汽車尾氣成分復雜，含多種化學物質，其主要分為有害氣體和顆粒物［7］。較長時間暴露于尾氣環(huán)境中，可造成機體多個系統(tǒng)損傷，主要表現在呼吸系統(tǒng)［8-9］、內分泌系統(tǒng)［10］、心腦血管系統(tǒng)［11］以及生殖系統(tǒng)等損傷［12］。而我們課題組則密切關注著汽車尾氣對生殖方面的不利影響。

構建可靠的汽車尾氣染毒裝置是開展該方向研究的前提條件。目前國內外已報道了多種汽車尾氣染毒模型的構建方法，常見的染毒模型主要包括腹腔注射或咽后壁注射機動車尾氣顆粒物(認可度較高)［11］、機動車怠速持續(xù)釋放汽車尾氣［13］、大流量氣體采樣器收集汽車尾氣提取物后腹腔注射、自制染毒缸、直接暴露于車流量較大的環(huán)境中等方法，建模周期、染毒時間和效果參差不齊。為了解決上述問題，我們設計并構建了一套簡單、科學有效的汽車尾氣染毒裝置，通過對裝置內氧氣濃度的測定以及小鼠致死時間的監(jiān)測，實現了在實驗小鼠存活的狀態(tài)下，提高單位時間內小鼠吸收汽車尾氣量的目的，成功構建了有效且建模周期短的尾氣染毒模型。

以人群為研究對象的研究［14］結果提示，汽車尾氣對男性生殖系統(tǒng)的最直接的影響表現在男性精液質量下降(精子密度、精子活力、精子活率等各方面較正常人均有所下降)。通過對雄鼠的研究，我們發(fā)現經過本自制汽車尾氣染毒裝置染毒40 d 后可以引起雄鼠精液質量下降，該結果與上述報道的現象相似;同時，我們還發(fā)現小鼠的附睪也發(fā)生一定程度的萎縮。由于精子從精原細胞發(fā)育為成熟的精子細胞的環(huán)節(jié)繁雜、相關調控因素眾多，汽車尾氣作用于其中的任何一個過程均會影響到最后的精液質量的高低。結合國內外現有報道，汽車尾氣損傷雄性生殖健康(尤其是精液質量下降)的初步機制可能與以下幾個方面的原因有關:①直接損傷生殖細胞;②影響下丘腦－垂體－性腺軸(內分泌失調、環(huán)境內分泌干擾物);③氧化應激反應引發(fā)的過氧化損傷［15］;④誘導睪丸中基因表達的改變等。我們在研究中也發(fā)現尾氣暴露組血液和睪丸內ROS的含量上升，同樣印證了汽車尾氣可能激活機體乃至睪丸組織的氧化應激反應，但具體是通過何種途徑引發(fā)氧化應激反應仍有待明確。

綜上所述，隨著全國汽車保有量的持續(xù)增加，尾氣排放所帶來的環(huán)境問題(尤其是霧霾)的關注度逐步增加。汽車尾氣可能給機體帶來的不利影響及機制有待深入研究，尤其是對男性生殖健康的影響方面。本研究構建的汽車尾氣的染毒裝置和染毒方法，為我們在該方向上進一步深入研究具體的作用靶點創(chuàng)造了條件，從而有益于尋找到新的預防和診治的切入點。

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