現(xiàn)代分子技術(shù)在堆肥微生物研究中的應(yīng)用

郭 艷

(商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 商丘 476000)

現(xiàn)代分子技術(shù)在堆肥微生物研究中的應(yīng)用

郭 艷

(商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 商丘 476000)

堆肥微生物是實現(xiàn)固體廢物資源化、無害化、減量化的執(zhí)行者和實施者，成為當(dāng)前的研究熱點.了解堆肥過程中所有重要菌群的組成和演替規(guī)律是選育復(fù)合微生物菌劑、調(diào)控堆肥過程的基礎(chǔ).但是特定生境中大多數(shù)微生物處于“存活而不能培養(yǎng)”狀態(tài)，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為堆肥微生物的研究提供了新的途徑.本文綜述了分子生物學(xué)技術(shù)在堆肥微生物研究中的應(yīng)用進展情況，并對其發(fā)展前景進行了展望.

現(xiàn)代分子技術(shù); 堆肥; 微生物

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；?、集約化程度越來越高，養(yǎng)殖場廢棄物給環(huán)境造成的污染日益嚴(yán)重，目前，如何消納數(shù)量巨大的養(yǎng)殖廢棄物成為制約我國畜牧業(yè)發(fā)展的首要問題.堆肥作為固體廢物資源化的有效途徑[1-3]，受到人們的關(guān)注.

堆肥的實質(zhì)是微生物在適宜條件下的代謝作用[4]，但是堆肥過程中復(fù)雜的微生物組成結(jié)構(gòu)和更替規(guī)律，僅依賴常規(guī)的分離培養(yǎng)技術(shù)已不能滿足現(xiàn)代研究的需要，而且非培養(yǎng)菌的存在也給堆肥微生物的研究提出了新的挑戰(zhàn).現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，彌補了傳統(tǒng)方法的不足，為堆肥微生物的研究開辟了新的途徑，也為堆肥復(fù)合菌系的選育和控制堆肥過程提供行之有效的手段.

目前，在以各種物料為底物進行堆肥的過程中，堆肥微生物都成為研究熱點.本文就當(dāng)前國內(nèi)外對現(xiàn)代分子技術(shù)在堆肥微生物研究中的應(yīng)用進展情況做個綜述，并對其發(fā)展趨勢作出展望.

1 16S /18S rRNA/DNA序列分析技術(shù)

rRNA是生物體細(xì)胞中最古老的分子之一，被稱為分子系統(tǒng)學(xué)研究的“活化石”，常常作為研究科內(nèi)、屬內(nèi)、種內(nèi)間的分子系統(tǒng)演化及物種鑒別的重要分子標(biāo)記.一般認(rèn)為，rDNA在生物中是高度保守的，其編碼區(qū)序列具有高度的同源性，在系統(tǒng)上主要用于屬于系統(tǒng)學(xué)研究，而非編碼區(qū)序列常用與種間及種下等級的系統(tǒng)學(xué)研究.

以16S /18S rRNA/DNA序列分析為基礎(chǔ)的16S /18S rRNA/DNA分子標(biāo)記技術(shù)無需培養(yǎng)微生物，不僅能對分子特性進行研究，而且能夠用于數(shù)量檢測和預(yù)測自然進化關(guān)系以及物種分類.現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到人畜動物胃腸道微生態(tài)、垃圾滲濾液、土壤微生物、病原菌檢測、石油勘探等環(huán)境樣品的研究中，在堆肥中的應(yīng)用大大促進了人們對堆肥微生物的全面了解.

Yamamoto等[5]通過構(gòu)建古生菌16S rRNA基因克隆文庫對牛糞堆肥中的古生菌群落動態(tài)和氨氧化古菌進行了研究.結(jié)果表明產(chǎn)甲烷古菌和氨氧化古菌在整個堆肥過程中都是優(yōu)勢菌，在堆肥開始的前2 d主要包括Methanocorpusculum和Methanosarcina類似序列，而CandidatusNitrososphaera類似序列的數(shù)量從堆肥的第6 d至第30 d之間一直在增加，Methanosarcinathermophila類似序列從第2 d起成為優(yōu)勢菌種，說明M.thermophila菌種能夠適應(yīng)溫度增加或營養(yǎng)損失的環(huán)境條件.通過對古生菌amoA基因的DGGE分析顯示amoA基因序列99%同源于Nitrososphaeragargensis，而且從不同的堆肥廠的堆肥樣品中均得到了相同的研究結(jié)果.這些研究數(shù)據(jù)說明氨氧化古菌在堆肥過程中起著重要的氨氧化作用.

Hayat等[6]為了研究細(xì)菌菌株的植物促生長活動和對小麥生長的積極作用，對水果和蔬菜廢棄物堆肥中的細(xì)菌進行了分離和鑒定.對分離到的14個細(xì)菌菌株進行了純化培養(yǎng).另外為了研究其生化反應(yīng)特征，對這14個細(xì)菌菌株分別進行了植物促生長特征檢測，比如溶磷作用研究、nifH基因擴增、吲哚-3-醋酸量化分析，以及產(chǎn)物氨、氧化酶和過氧化氫酶分析.通過16S rRNA基因序列分析顯示14個細(xì)菌菌株被認(rèn)定為屬于Bacillus,Lysinibacillus,Lysobacter,Staphylococcus,Enterobacter,PseudomonasandSerratia.分離到的細(xì)菌菌株都能夠溶解磷酸三鈣產(chǎn)生吲哚-3-醋酸，其中2株(RHC-8和RHC-13)溶解量最大，分別達到486 μg/ml 和和 464 μg/ml，分別被認(rèn)定為是EnterobacteraerogenesandPseudomonasbrenneri.

Charbonneau等[7]從堆肥中分離得到了10個嗜熱細(xì)菌菌株，通過16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和生化特征研究認(rèn)為屬于4個屬Geobacillusthermodenitrificans,Bacillussmithii,Ureibacillussuwonensis和Aneurinibacillusthermoaerophilus.

Xu等[8]運用定量PCR和常規(guī)PCR技術(shù)來評價染疫牛尸體堆肥化中牛和植物DNA的生物降解作用.堆體結(jié)構(gòu)由16頭牛尸體放置在40 cm厚的稻草上，然后覆蓋160 cm飼養(yǎng)場糞便組成.于堆體80 cm和160 cm處采集堆肥樣品分別命名為P80和P160，而DNA降解的評估在靜態(tài)堆肥化的147 d和動態(tài)堆肥的180 d進行.尸體剩余的軟組織樣品在堆肥147 d的時候采集.從P80樣品中得到171bp的牛線粒體DNA片段(Mt171)和138bp的植物二磷酸核酮糖羧化酶基因片段(Rub138)的拷貝數(shù)相對于最初的拷貝數(shù)分別減少79%和99%，而P160樣品中，Mt171和Rub138的拷貝數(shù)分別減少20%和99%.327 d后，Mt171的降解增加到91%.與新鮮的組織樣相比，在147 d剩余的組織樣基因組DNA產(chǎn)量減少了99%.

Neher等[9]組織了3種不同碳源的堆體.堆體1是采用100%的牛糞和青貯飼料堆制，C∶N為17∶1，作為對照；堆體2是用干草作為碳源，牛糞和青貯飼料的體積比為3∶1，堆體的碳氮比為23∶1；堆體3是硬木樹皮作為碳源，牛糞青貯飼料、硬木樹皮、軟木材刨花的體積比為5∶5∶3，堆體的碳氮比為34∶1.對從這3種堆肥中獲得的細(xì)菌16S rRNA和真菌的18S rRNA基因片段進行高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌群落均存在于兩種堆肥中.牛糞和干草堆肥中細(xì)菌群落含有大量的厚壁菌門細(xì)菌，而硬木樹皮和干草堆肥中則存在大量的放線菌和芽單胞菌.牛糞青貯飼料堆體中的真菌以Pezizomycetes和Microascales為主，牛糞和干草堆肥中存在特有的真菌類群，包括Epicoccum,Thermomyces,Eurotium,Arthrobotrys和Myriococcum，而硬木樹皮和干草堆肥中則存在大量的Sordariomycetes.

隨著核酸數(shù)據(jù)庫的不斷補充和完善，16S /18S rRNA/DNA分子標(biāo)記技術(shù)因其可對復(fù)雜環(huán)境微生物進行快速、微量、準(zhǔn)確簡便分類和檢測的特點，將會在各個領(lǐng)域進行更廣泛的應(yīng)用.

2 分子雜交技術(shù)

分子雜交技術(shù)是一種最常用的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列片段的有力工具，其原理是具有一定同源序列的兩條核酸單鏈(DNA或RNA)，在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程.利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列.用作探針的DNA或RNA片段常常用放射性同位素、生物素或熒光素進行標(biāo)記.

核酸分子雜交技術(shù)按雜交中單鏈核酸所處的狀態(tài)可分為液相、固相和原位3類.前二類方法都要求預(yù)先從細(xì)胞中分離并純化雜交用的核酸.在液相分子雜交中，兩種來源的核酸分子都處于溶液中，可以自由運動，其中一種常用同位素標(biāo)記.在固相分子雜交中，一種核酸分子被固定在不溶性的介質(zhì)上，另一種核酸分子則處在溶液中，兩種介質(zhì)中的核酸分子可以自由接觸.常用的介質(zhì)有硝酸纖維素濾膜、羥基磷灰石柱、瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠等.原位雜交實際上是固相雜交的另一種形式，雜交中的一種DNA處在未經(jīng)抽提的染色體上，并在原來位置上被變性成單鏈，再和探針進行分子雜交.

2.1 探針雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)在堆肥微生物的研究中已有應(yīng)用.Hultman等[10]提出在構(gòu)建的克隆文庫中采用探針陰性篩選法可以減少測序的克隆子數(shù)目，節(jié)約測序費用，避免對已知微生物重復(fù)測序，加速對環(huán)境微生物的認(rèn)知進程，而且他們指出這種方法特別適用于對環(huán)境樣品中非優(yōu)勢菌的檢測.Schloss等[11]采用16S rRNA基因探針對堆肥過程中的細(xì)菌群落的動態(tài)變化進行了研究.結(jié)果表明，假單胞菌屬和低G+C含量的革蘭氏陽性菌的特異性探針能夠達到16%-87%的結(jié)合率.

2.2 熒光原位雜交

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是在放射性原位雜交技術(shù)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)，通過利用標(biāo)記的DNA或RNA探針直接與細(xì)胞、組織或染色體原位雜交和熒光顯色，繞開了DNA提取和基因分離等步驟，可直接對特定細(xì)胞、組織或染色體上特定靶核苷酸序列進行定性、定位、相對定量分析.與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高、原位等特點，而且可以同時利用不同熒光素對多個靶序列進行定位，因此在動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進化等許多領(lǐng)域中都得到了廣泛應(yīng)用.

同樣，F(xiàn)ISH技術(shù)也被導(dǎo)入到堆肥微生態(tài)研究中.Yi等[12]運用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)對豬糞堆肥過程中的芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌進行了時空分布研究.在堆體的每一層都檢測到了總細(xì)菌、芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌的存在，時間分布特征是三者在數(shù)量上高溫期明顯高于降溫期，降溫期高于升溫期.總細(xì)菌的數(shù)量分布在降溫期達到平衡.芽孢桿菌屬細(xì)菌的空間分布特征是在堆肥的每個階段中中層的數(shù)量和相對豐度都是最低的，而梭菌屬細(xì)菌在除了高溫期上層樣品之外的其它各個堆肥樣品中均顯示出了較高的相對豐度，但是空間分布特征不明顯.三者的FISH檢測數(shù)量級都達到了106個/g(濕重)的數(shù)量級.

2.3 微陣列技術(shù)

微陣列技術(shù)是1995年由Schena[13]創(chuàng)立的，最初是用來進行基因表達研究的，但以后的幾十年間，此項技術(shù)已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界以及工業(yè)界實驗室研究高通量基因表達的常規(guī)技術(shù)，能夠通過比較一大批基因在不同的組織、不同類型的細(xì)胞以及不同環(huán)境條件下的表達情況，從而發(fā)現(xiàn)基因的功能活性和代謝網(wǎng)絡(luò)，成為功能基因組學(xué)研究的強有力工具.根據(jù)探針的類型可將微陣列分為3類：功能基因微陣列、群落基因組微陣列和系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸微陣列. 由于寡核苷酸微陣列特異性高，已經(jīng)成為復(fù)雜環(huán)境樣本微生物生態(tài)學(xué)研究的重要方法.

Shemekite等[14]采用分子技術(shù)(DGGE和COMPOCHIP微陣列)和傳統(tǒng)計數(shù)法對咖啡殼堆肥中的細(xì)菌變化進行了研究.他們組織了3個堆體，由咖啡殼和牛糞組成堆體1，咖啡殼、牛糞、果蔬廢棄物組成堆體2，而堆體3只有咖啡殼.堆肥樣品分別在堆體當(dāng)天、32 d河90 d的時候采集，并進行化學(xué)和微生物學(xué)分析.堆體1和堆體2的C/N在90 d后明顯下降.計數(shù)結(jié)果顯示在堆肥開始時細(xì)菌數(shù)量最多，而在堆肥結(jié)束時放線菌的含量最多，表明微生物的演替與堆肥過程中有關(guān)酶的產(chǎn)生有關(guān).rDNA的DGGE和微陣列分析結(jié)果表明堆肥過程中存在著獨特的微生物群落變化，堆肥當(dāng)天樣品的微生物聚類單獨于32 d和90 d的堆肥微生物類群.他們采用多參數(shù)方法揭示了3種堆體中的微生物在物種多樣性和量上都存在差異.

3 分子標(biāo)記技術(shù)

16S /18S rRNA/DNA序列分析技術(shù)雖然能夠?qū)Νh(huán)境中各種微生物進行量化，但是工作量大，要進行大量的測序工作，時間周期長且不經(jīng)濟，而且要求要有足夠的克隆子數(shù)才能準(zhǔn)確反映環(huán)境中真實的微生物群落組成情況.近年來，可用于監(jiān)測微生物群落結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化過程的分子標(biāo)記技術(shù)被廣大科研工作者引入到微生態(tài)研究中，并且發(fā)揮了巨大的作用.

3.1 RFLP和ARDRA

限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù).RFLP是指DNA序列上由于堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的酶切位點的改變，最終導(dǎo)致限制性片段長度的差異.擴增性rDNA限制性酶切片斷分析 (Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis, ARDRA)是美國最新發(fā)展起來的將PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合衍生的一項現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)，其原理是基于原核生物rDNA序列的保守性，將擴增的rDNA片段進行酶切，然后通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性.在微生物遺傳多樣性和分類上具有重要意義.

該項技術(shù)的方法是：從環(huán)境樣本中獲得高質(zhì)量的微生物總DNA；以總DNA為模板，根據(jù)微生物rDNA序列的保守性設(shè)計引物，采用PCR技術(shù)將目的rDNA片斷擴增出來；選擇2-5種四堿基識別位點的限制性內(nèi)切酶，對擴增產(chǎn)物進行限制性酶切；通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性.

現(xiàn)在ARDRA技術(shù)在微生態(tài)研究中的應(yīng)用多是結(jié)合16S /18S rDNA序列分析，目的在于在測序前先運用ARDRA技術(shù)將環(huán)境微生物中克隆的眾多16S /18S rDNA片段分為多個OTUs，然后再從各個OUT中挑選1-3個克隆子進行16S /18S rRNA基因測序，這樣既不影響真實的微生物多樣性又能夠節(jié)約測序費用.

Chandna等[15]利用16S rDNA序列分析方法和ARDRA技術(shù)對農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品(米糠、麥麩、稻殼等)堆肥中的細(xì)菌多樣性進行了評估.通過對從堆肥中分離到的細(xì)菌菌株進行16S rRNA基因測序，分析結(jié)果表明：33個細(xì)菌菌株隸屬Bacilli, γ, β-Proteobacteria和Actinobacteria.其中Bacilli類群由Staphylococcus,Bacillus,Terribacillus,和Lysinibacillus4個屬組成；由Microbacteriumbarkeri和Kocuriasp. 組成Actinobacteria類群；而另一個類群則是由Comamonas、Acidovorax組成的β-Proteobacteria和Serratia,Klebsiella, andEnterobacter組成的γ-Proteobacteria構(gòu)成.類似的分析結(jié)果在這個試驗中也由另一項分子技術(shù)ARDRA分析得到，采用HpaII,HinfI,和MspI三種限制性內(nèi)切酶對得到的16S rDNA序列分別進行酶切：HpaII 得到了數(shù)量不等的條帶(2-6條)，片段大小介于90bp至688 bp之間；HinfI 得到了2至5條片段大小介于71bp至1038 bp的條帶；而MspI 得到了介于69 bp至793 bp之間的 2至7 條條帶.二者分析的結(jié)果雖然十分接近但并不重疊，但是二者相比來說，ARDRA卻能夠在36 h內(nèi)實現(xiàn)對堆肥樣品的快速分析.

3.2 SSCP

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)是基于DNA構(gòu)象差別來檢測點突變的方法.長度相同的單鏈如果存在一個堿基的差別，就會引起空間構(gòu)象的改變，在聚丙烯凝膠中由于所受阻力不同而被分開.其基本過程是：①PCR擴增靶DNA；②將PCR產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；③將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；④最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變.

c：Last December,the Post first reported that probes were being made in each of these cities,but officials refused to confirmthe story.

Sen等[16]采用PCR-SSCP技術(shù)對實驗室條件下的蚯蚓堆肥過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異進行了研究.結(jié)果表明在堆肥過程中細(xì)菌多樣性呈上升趨勢，在腐熟階段保持穩(wěn)定.然而在堆肥的起始階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一個快速的變化.多變量分析證明每一次的蚯蚓堆肥中存在不同的細(xì)菌群落演化模式而且沒有與之嚴(yán)格相對應(yīng)的物理化學(xué)指標(biāo)的變化.

3.3 T-RFLP

末端限制性片段長度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism, T-RLFP)，又稱為16S rRNA基因的末端限制性片段(terminal restriction fragmen, TRF)，是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種新興的研究微生物多態(tài)性的分子生物學(xué)方法.該方法克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的限制、應(yīng)用快速、靈敏度高且輸出定量的數(shù)據(jù)結(jié)果，現(xiàn)已被成功應(yīng)用到菌種鑒定、群落對比分析、群落中系統(tǒng)發(fā)育種群多樣性的評估等領(lǐng)域.該技術(shù)的基本原理是根據(jù)16S rDNA序列保守區(qū)設(shè)計通用引物，其中一個引物的5′端用HEX(六氯熒光素)、TET (4, 7, 2 7 -四氯-6-羧基熒光素)或5(6)-FAM(亞磷酰胺-5(6)-羧酸熒光素)等熒光物質(zhì)標(biāo)記.以樣品總DNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的一端帶有熒光標(biāo)記，再用合適的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，由于在不同細(xì)菌的擴增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點就會存在差異，酶切后就會產(chǎn)生很多不同長度的限制性片段.消化產(chǎn)物用DNA自動測序儀分離，通過激光掃描，得到帶熒光標(biāo)記端的圖譜，而其它沒帶熒光標(biāo)記的片段則檢測不到.由于每種菌末端帶熒光標(biāo)記的片段(terminal restriction fragment, TRF )長度是惟一的，所以峰值圖中每一個峰至少代表一種菌，每個峰的面積占總面積的百分比則代表這種菌的相對數(shù)量，它提供了關(guān)于多樣性的信息，卻簡化了條帶圖譜，可以分析復(fù)雜群落.條帶組成還可以被用來度量不同樣品中種的豐富度、平均度和相似性.但是該技術(shù)中所用引物均是根據(jù)已有的數(shù)據(jù)庫里16S, 18S rRNA和ITS信息設(shè)計的，也就是說這些引物只代表了可培養(yǎng)微生物類群，并沒有代表實際樣品中真正的微生物多樣性.要想進一步了解樣本中的微生物組成，還要結(jié)合測序等技術(shù)手段.

Székely等[17]結(jié)合DGGE和末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)對蘑菇堆肥產(chǎn)物中的細(xì)菌演替進行了分析.每個DGGE條帶重擴增并進行序列分析.指紋的主成分分析顯示細(xì)菌群落的密集變化主要體現(xiàn)在22 d期間.高溫堆肥樣品中嗜熱細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢.采用兩種方法(DGGE和T-RFLP)對腐熟堆肥進行分析的結(jié)果幾乎一致.為了深入了解腐熟堆肥的細(xì)菌群落，純培養(yǎng)獲得的細(xì)菌16S rDNA序列和堆肥環(huán)境樣品的16S rDNA文庫的序列信息與該環(huán)境樣品的T-RFLP指紋分析結(jié)果進行了獨特的耦合比較，比較結(jié)果揭示了主導(dǎo)纖維素降解的微生物團體與Pseudoxanthomonas,Thermobifida和Thermomonospora有關(guān).

3.4 DGGE/TGGE

變性梯度凝膠電泳 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)，是兩個相似的研究微生物多樣性的方法.這種技術(shù)最初是為了檢測DNA序列中的點突變.Muyzer等[11]在1993年首次將其應(yīng)用到微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中.之后，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用到微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個領(lǐng)域中，目前已經(jīng)成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一.

Yi等[18]為了獲得豬糞堆肥過程中芽孢桿菌的分子系統(tǒng)發(fā)育多樣性和空間分布，綜合運用了傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)(PCR-RFLP和DGGE)對堆肥樣品進行了分析.他們首次從堆肥中分離到芽孢桿菌，基于溫度的變化，芽孢桿菌有明顯的時空特征分布，在高溫期檢測到的可培養(yǎng)芽孢桿菌的數(shù)量在堆體的每一層都是最多的，而在堆肥的每個階段中中層檢測到的芽孢桿菌的數(shù)量都是最低的.而且對從不同的堆肥階段分離到540個單菌落進行了RFLP和16S rDNA測序分析，結(jié)果顯示獲得的可培養(yǎng)芽孢桿菌的多樣性比較低，分別隸屬于Bacillussubtilis,Bacilluscereus,Bacillusthuringiensis,Bacillusanthracis,Bacillusmegaterium,Bacilluslicheniformis,Bacilluspumilus, andBacilluscirculans. 其中，B.subtilis是優(yōu)勢種，在升溫期和降溫期的中層堆肥樣品中都具有最高的芽孢桿菌多樣性.通過DGGE分析和構(gòu)建16S rRNA片段克隆文庫，結(jié)果顯示芽孢桿菌的時空分布不明顯，67%的非培養(yǎng)細(xì)菌屬于芽孢桿菌.他們研究認(rèn)為綜合運用培養(yǎng)和非培養(yǎng)方法能夠有效的揭示堆肥過程中芽孢桿菌的多樣性和時空分布.

Yamamoto等[19]為了探明氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌在牛糞、豬糞和雞糞堆肥過程中的分布規(guī)律，對三種畜禽堆肥樣品分別進行了分子生物學(xué)分析.變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析結(jié)果顯示Nitrososphaeragargensis候選種的類似序列在牛糞堆肥樣品中占據(jù)絕對優(yōu)勢，而在其它的兩種堆肥樣品中幾乎沒有氨氧化古菌的存在.至于氨氧化細(xì)菌，在牛糞和豬糞堆肥樣品中亞硝化單胞菌類似序列被檢測出具有更高的多樣性.亞硝酸細(xì)菌的相對豐度通過實時定量熒光PCR分析顯示在牛糞和雞糞堆肥樣品中存在更多的氨氧化細(xì)菌.總的試驗結(jié)果表明氨氧化細(xì)菌更廣泛的分布于動物糞便堆肥中.

Wang等[20]為了深入了解放線菌群落在堆肥中的多樣性和動力學(xué)變化，采用RT-PCR、DGGE和構(gòu)建克隆文庫的方法對小規(guī)模堆肥廠的堆肥樣品進行了分析.定量實時PCR分析數(shù)據(jù)顯示放線菌占堆肥樣品中細(xì)菌總數(shù)的18%-86%，腐熟階段達到頂峰，說明放線菌是堆肥生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成成分.定性分析顯示放線菌的14個不同的屬和一個未知群落均在堆肥中檢測到了而且放線菌群落表現(xiàn)出明顯的時間變化，表明溫度影響放線菌群落的變化.特別指出的是，在堆肥的最初階段致病性的棒狀桿菌占據(jù)優(yōu)勢，在高溫階段糖單孢菌屬和嗜熱菌豐度最高.在腐熟的堆肥中，嗜溫微球菌最常見.在堆肥中嗜熱菌和微球菌對木質(zhì)纖維素的降解可能起到共同的促進作用.

4 實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)

定量PCR是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù).實時熒光定量PCR技術(shù)(rea1-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法.該技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性強、自動化和重復(fù)性好、無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域.

實時熒光定量PCR技術(shù)在堆肥微生物的研究中也得到了應(yīng)用.Sharma等[21]采用RT-qPCR技術(shù)，通過對堆肥中的甲烷菌和甲烷氧化菌的mcrA,pmoA拷貝數(shù)的變化來間接的估計兩種菌群的群落變化.在堆肥過程中，甲烷菌和甲烷氧化菌群落的活性影響著釋放到大氣中的凈甲烷量.定量分析結(jié)果表明上層和中層樣品中mcrA,pmoA基因拷貝數(shù)存在明顯差異，mcrA拷貝數(shù)在15周的堆肥期間內(nèi)恒定，而pmoA隨著時間發(fā)生了顯著的變化，0-1周數(shù)值較高，11周時數(shù)值最低.凈甲烷的釋放量在15周內(nèi)與pmoA基因拷貝數(shù)的變化有關(guān)，當(dāng)mcrA∶pmoA的比例高時甲烷的釋放量就高.實驗結(jié)果證明mcrA,pmoA基因拷貝數(shù)在牛糞堆肥過程中發(fā)生變化，甲烷菌和甲烷氧化菌的數(shù)量多少還需要結(jié)合凈甲烷釋放量來綜合考慮.

5 展 望

進行大型養(yǎng)殖場廢棄物無害化處理及高效利用，是當(dāng)前我國養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；l(fā)展與環(huán)境保護面臨的難題.而現(xiàn)代先進的分子生物學(xué)技術(shù)和研究手段，可直接對堆肥微生物的總DNA進行研究，突破了菌株分離和培養(yǎng)的限制，有助于我們更加深入全面的了解堆肥系統(tǒng)中微生物群落的演替規(guī)律和過程，為推動堆肥理論和技術(shù)的發(fā)展提供生物學(xué)證據(jù)，并可能發(fā)現(xiàn)新的微生物種.但這些方法也有自身的局限性，比如分析結(jié)果受樣品的采集方法、總DNA提取方法等的影響，因此，在研究過程中最好能夠?qū)⒎肿由飳W(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)分析方法相結(jié)合，得到科學(xué)合理的結(jié)果.

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【責(zé)任編輯：徐明忠】

Application of modern molecular techniques on research composting microbiology

GUO Yan

(Department of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000,China)

Composting microbiology as an executor and enforcer to realize the reclamation, harmless and reduction of solid waste have been a hotspot currently. To understand the bacteria community and the succession order of the important microbe were the foundation to select complex microbial community and control composting process. Due to the “viable but nonculturable” of many microorganism in certain habitat, but with the development of modern molecular biotechnology which provide the new way to research the composting microbe. It was concluded that the progress on the application of some molecular biotechnology on composting microbe, and trend of development potential was reviewed also.

modern molecular techniques;composting;microbe

2014-08-29;

2014-09-05

河南省科技廳科技攻關(guān)項目(102102310391)；河南省科技廳科技攻關(guān)項目(132102210551)；河南省教育廳自然基金項目(2010B530001)；商丘師范學(xué)院青年骨干教師資助項目；商丘師范學(xué)院青年科研基金項目(2011QN19)

郭艷(1977-)，女，河南商丘人，商丘師范學(xué)院副教授，博士研究生，主要從事畜禽糞污處理及環(huán)境微生物學(xué)的研究.

TP393

A

1672-3600(2015)03-0060-06