肺纖維化動物模型的研究進(jìn)展

楊曉燕，沈杰,2

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200052

間質(zhì)性肺炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎常見的并發(fā)癥，增加了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎6%的死亡率[1]。目前關(guān)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并發(fā)間質(zhì)性肺炎缺乏療效肯定的治療方案。在探索類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾病治療的實(shí)驗(yàn)研究中，合適的動物模型是成功的重要條件。研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺疾病最常見的病理類型是普通型間質(zhì)性肺炎（usual interstitial pneumonitis，UIP）[2-3]，在實(shí)驗(yàn)造模中常參考肺間質(zhì)纖維化的動物模型。但仍缺乏特異性的，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺炎發(fā)病機(jī)制及病理類型更接近的動物模型。在此，我們將就目前較常用的肺纖維化動物模型的建立方法進(jìn)行簡要總結(jié)。

1 博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化動物模型

目前國際上應(yīng)用最為廣泛的就是博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化動物模型。博來霉素是從輪枝鏈霉菌中提取的一種抗腫瘤藥物，我國從放線菌菌株72號中分離出同樣的抗生素。作為抗腫瘤藥物，博來霉素應(yīng)用于臨床時(shí)常見的副作用是引起肺炎及肺纖維化癥狀，因而是肺纖維化動物模型最常用的誘導(dǎo)劑。在實(shí)驗(yàn)中常用的是日本生產(chǎn)的博來霉素，國內(nèi)也有研究者采用國產(chǎn)的平陽霉素，平陽霉素是博來霉素的單體，其毒性較小。

1.1 動物品系的選擇

劉蓉[4]等采用氣管內(nèi)注射博萊霉素的方法，比較BALB/c、C57BL/6及KM小鼠3種品系的肺纖維化的程度，光鏡下觀察各模型組肺組織均呈不同程度的纖維化，C57BL/6小鼠最明顯；BALB/c小鼠肺纖維化模型組肺損傷程度及纖維化程度較輕，成功率僅70%；KM 小鼠肺纖維化程度介于二者之間，且有2只小鼠未出現(xiàn)肺纖維化。C57BL/6小鼠肺纖維化的程度較為理想。也有人比較了C57BL/6與ICR 小鼠2 種品系的造模效果，采用經(jīng)尾靜脈一次性注射博來霉素150 mg/kg 的方法誘導(dǎo)2 種種屬的小鼠肺間質(zhì)纖維化，結(jié)果C57BL/6 組小鼠出現(xiàn)明顯的肺間質(zhì)纖維化，ICR 組小鼠未見明顯纖維化形成，2 組之間存在著明顯的差異。說明C57BL/6 小鼠較ICR 小鼠更適于博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型[5]。國外研究中也多采用C57BL/6小鼠建立肺纖維化動物模型。C57BL/6小鼠是小鼠肺纖維化模型中最常用的小鼠品系。

大鼠也是肺纖維化模型常用動物[6]。至于品系，未見相關(guān)文獻(xiàn)比較SD 大鼠與Wistar 大鼠在肺纖維化模型建立中的差異。國內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，2 種大鼠均常用于肺纖維化模型的建立[7-9]。

1.2 造模方法的選擇

目前最常用的博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化動物模型的方法是一次性氣管內(nèi)灌注。氣管內(nèi)灌注又分為直接灌注和間接灌注。直接灌注法是通過氣管插管向動物氣管內(nèi)灌注博來霉素；間接灌注法是在動物頸部切口，鈍性分離，找到氣管后向氣管內(nèi)注入博來霉素。2 種方法在灌注后都需要將小鼠旋轉(zhuǎn)，以便藥物在肺部能夠分布均勻，肺部纖維化程度均勻。李偉峰、王聰?shù)仁褂肕icroSprayere 霧化器（美國PENN-CENTURY）氣管內(nèi)霧化的方法建立動物模型，并與氣管內(nèi)滴注方法相比較，結(jié)果顯示2種方法均能夠引起肺纖維化，但氣管內(nèi)滴注組小鼠肺纖維化程度不一，病灶分布不均；而氣管內(nèi)霧化組小鼠肺纖維化病灶分布均勻，更適合用于小鼠肺纖維化模型[10-11]。國外研究者[12]也使用了這種霧化裝置向大鼠氣管內(nèi)霧化博來霉素，誘導(dǎo)大鼠肺間質(zhì)纖維化，降低了大鼠感染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了造模成功率及肺內(nèi)纖維化病灶分布的均勻程度。但這種裝置價(jià)格較貴，成本高。周歡[13]使用同種微型霧化器氣管內(nèi)霧化建立肺纖維化動物模型，雖然復(fù)制出肺纖維化模型，但成功率及肺纖維化均勻程度并不高，且操作復(fù)雜。國內(nèi)也有學(xué)者使用其他造模方法，如霧化吸入、經(jīng)鼻滴注、尾靜脈注射、腹腔注射等。劉珊[14]等比較了霧化吸入和氣管內(nèi)灌注方法建立的肺纖維化模型，認(rèn)為霧化吸入法操作簡便，吸入藥物在肺內(nèi)分布均勻，是一種較為理想實(shí)用的肺纖維化造模方法。該實(shí)驗(yàn)研究分別設(shè)置了霧化吸入2.5 g/L（0.25%）博來霉素稀釋液15 min、1 h、2 h、6 h 組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示15 min、1 h、2 h 組小鼠均無明顯的肺纖維化，僅霧化6 h 組小鼠病理可見明顯的肺纖維化，因此推斷提高博來霉素濃度5 g/L（0.5%），并將霧化時(shí)間定為3 h可能獲得理想的肺纖維化模型。但該推斷并未獲得證實(shí)，且5 g/L（0.5%）博來霉素霧化3 h需要消耗大量的博來霉素，提高了成本。盡管霧化吸入可以使小鼠肺纖維化分布均勻，但霧化吸入并不能確定每只小鼠吸入的博來霉素量，不能很好地控制小鼠的肺纖維化程度，且霧化時(shí)間過長，造模需要消耗大量時(shí)間。因此，霧化吸入在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用并不多。高占成[15]等在通過連續(xù)3 d 鼻滴入博來霉素的方法建立了肺纖維化動物模型，但胡靜[16]等應(yīng)用高占成的方法并未成功地建立模型，他們改良了這種造模方法，一次性鼻滴入博來霉素，建立了肺纖維化模型。不過，該實(shí)驗(yàn)并未設(shè)置氣管內(nèi)滴注組與鼻滴入法對照，雖然鼻滴入較氣管內(nèi)滴注操作簡便，對小鼠損傷較小，但尚缺肺纖維化程度的比較。孟婕[17-18]等研究了連續(xù)多次尾靜脈注射博來霉素造模的方法，并與氣管內(nèi)灌注法對比，兩者均能成功地復(fù)制出肺纖維化模型，但尾靜脈注射組病灶主要分布在胸膜下及血管周圍，而氣管內(nèi)灌注組主要分布在支氣管和細(xì)支氣管周圍，尾靜脈注射組病灶的分布特點(diǎn)更接近于特發(fā)性肺纖維化，且尾靜脈注射法小鼠病死率較低，但連續(xù)多次尾靜脈注射操作不如一次性氣管內(nèi)灌注簡便。楊聰穎、肖強(qiáng)[19-20]等通過對比不同劑量一次性尾靜脈注射及多次尾靜脈注射的造模方法，認(rèn)為尾靜脈單次注射博萊霉素200 mg/kg 可有效誘導(dǎo)肺纖維化，復(fù)制一個(gè)相對穩(wěn)定的肺纖維化模型。這種方法相對于多次尾靜脈注射方法簡便得多，但用藥劑量較大。此外，齊曼古麗·吾守爾[21]對比了腹腔注射與氣管內(nèi)灌注的方法，認(rèn)為腹腔內(nèi)給藥法具有給藥次數(shù)多、劑量大、制模時(shí)間長等缺點(diǎn)，但動物死亡率相對較低，且操作簡便，病灶分布均勻。值得一提的是，以上經(jīng)鼻滴入、尾靜脈注射方法建立的模型均采用ICR 小鼠，可見小鼠品系的選擇并不絕對，與造模方法有關(guān)。

1.3 藥物劑量的選擇

氣管內(nèi)灌注博來霉素誘導(dǎo)動物肺纖維化模型的方法雖然最常用，但博來霉素的用量國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。陶章[22]等分別用2、3.5、5 mg/kg 博來霉素造模，3 組均能成功地建立小鼠肺纖維化模型，但5 mg/kg組動物死亡率較其余2組高，綜合考慮肺纖維化程度及小鼠的生存率，作者認(rèn)為選取3.5 mg/kg博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維較為合適。鼻滴入、尾靜脈注射、腹腔注射等方法因?qū)游飺p傷較小、死亡率低，尚未見關(guān)于這幾種造模方法藥物劑量選擇的研究報(bào)道。

2 百草枯誘導(dǎo)肺纖維化動物模型

近年來，國內(nèi)不少研究者使用百草枯誘導(dǎo)動物肺纖維化。百草枯為聯(lián)吡啶類化合物，化學(xué)名為1，1-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶鎓鹽，是一種速效觸殺除草劑。百草枯中毒的靶器官主要是肺臟，百草枯中毒后除急性死亡外，非急性死亡的病人多在15～30 d發(fā)生肺纖維化[23-24]。

2.1 動物品系的選擇

使用百草枯誘導(dǎo)動物肺纖維化常選用的動物有小鼠、大鼠、家兔等。楊珊珊[25]等通過分別對KM、ICR及C57BL/6J小鼠腹腔注射百草枯溶液10 mg/kg或20 mg/kg 建立肺纖維化模型，28 d 后處死小鼠，在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)KM 小鼠及ICR 小鼠肺組織均無明顯纖維化改變，僅C57BL/6J小鼠部分區(qū)域有輕度纖維化形成。說明3 種小鼠中，C57BL/6J 小鼠更適合小鼠肺纖維化模型的建立。但該實(shí)驗(yàn)選用的是腹腔注射的造模方法，如果選用氣管內(nèi)灌注方法進(jìn)行造模，也許結(jié)果不盡相同。關(guān)于動物品系的選擇，C57BL/6J 小鼠是國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的品系，幾乎適用于各種造模方法，但這并不能說明其他小鼠一定不能用來建立肺纖維化模型，這可能與造模方法有很大的關(guān)系，還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。

2.2 造模方法的選擇

使用百草枯建立肺纖維化模型，常見報(bào)道有一次性口服灌注、腹腔注射等造模方法。高燕[26]等選用KM小鼠，通過一次性灌胃百草枯100 mg/kg的方法建立肺纖維化模型，結(jié)果病理提示造模組肺組織3 d 時(shí)已出現(xiàn)嚴(yán)重炎性反應(yīng)，21 d 時(shí)肺組織呈明顯的纖維化改變。一次性口服灌胃方法操作簡便，對動物損傷小，可用來進(jìn)行肺纖維化的發(fā)病機(jī)理和藥物療效研究。尹江寧[27]也選用了一次性灌胃的方法建立了兔肺纖維化模型。楊珊珊[24]等選用一次性腹腔注射百草枯，盡管C57BL/6J小鼠組出現(xiàn)了肺纖維化，但程度輕，造模結(jié)果并不理想，可能與百草枯劑量過小有關(guān)。祝春青[28]等通過實(shí)驗(yàn)對比了一次性腹腔注射各劑量組的造模效果，結(jié)果各染毒組均出現(xiàn)不同程度的肺纖維化改變，且注射劑量越高，肺纖維化病變越嚴(yán)重，早期死亡率也越高。綜合各方面考慮，一次性腹腔注射百草枯40～50 mg/kg 可制備較合適的小鼠肺纖維化模型。

3 其他

除上述較常用的博來霉素及百草枯造模方法以外，也有研究者采用鹽酸模擬酸流吸入后對肺部造成的影響，觀察鹽酸（胃酸的主要成分）對肺部造成的損傷，建立肺纖維化模型[29]。有人選用氣管內(nèi)一次性注射攜帶TGF-β1 基因的腺病毒載體（AdTGFβ1223/225）誘導(dǎo)大鼠肺間質(zhì)纖維化。腺病毒誘發(fā)的肺纖維化具有發(fā)病急、炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈、細(xì)胞外基質(zhì)增生迅速、膠原纖維彌散度高等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)與特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）病理過程極為相近，有望成為研究IPF 發(fā)病機(jī)制的可靠動物模型[30]。也有人選用金黃色葡萄球菌L 型致間質(zhì)性肺炎的實(shí)驗(yàn)動物模型[31]，但該實(shí)驗(yàn)方法會造成小鼠多器官臟器發(fā)生間質(zhì)性炎癥改變，不適合間質(zhì)性肺炎的動物模型。

目前國內(nèi)外最常用、最受認(rèn)可的肺纖維化模型仍是一次性氣管內(nèi)灌注博來霉素誘導(dǎo)的動物肺纖維化[32]。然而這種方法操作技術(shù)要求高，動物耐受差，死亡率高，造成的肺纖維化病灶分布不均勻，尚須改進(jìn)方法，改善造模效果，提高動物生存率。國內(nèi)研究中的其他造模方法，也需要更多的實(shí)驗(yàn)證明其可重復(fù)性、可靠性?？傊?，需要探尋一種操作更簡便、更安全、可重復(fù)性高、肺纖維化分布更均勻、與肺纖維化臨床及病理特點(diǎn)更相似的動物模型。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)間質(zhì)性肺炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究表明可能與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者免疫異常有關(guān)[33]。雖然類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并發(fā)間質(zhì)性肺炎的病理類型多為普通型間質(zhì)性肺炎，這與我們常用的肺纖維化動物模型的病理類型相一致，但其發(fā)生機(jī)制與特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化可能存在差異。這就給類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并發(fā)間質(zhì)性肺炎的動物實(shí)驗(yàn)研究造成了困難。我們需要更多的研究來探索一種更貼近于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并發(fā)間質(zhì)性肺炎臨床特點(diǎn)的動物模型，以便于研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎并發(fā)間質(zhì)性肺炎的發(fā)病機(jī)制及治療方法。

[1]Bongartz T,Nannini C,Medina-Velasquez Y F,et al.Incidence and mortality of interstitial lung disease in rheumatoid arthritis:a population-based study[J].Arthritis Rheum,2010,62:1583-1591.

[2]Lee H,Kim D S,Yoo B,et al.Histopathologic pattern and clinical features of rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease[J].Chest,2005,127:2019-2027.

[3]Tanaka N,Kim J S,Newell J D,et al.Rheumatoid arthritisrelated lung diseases:CT findings[J].Radiology,2004,232:81-91.

[4]劉蓉,趙瑾,陳國勤,等.博萊霉素致不同品種品系小鼠肺纖維化模型的比較研究[A]//中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)會.第九屆中國實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)年會（2010新疆）論文集[C].2010:5.

[5]宋淑范,張曉曄.博來霉素誘導(dǎo)G57BL/6 與ICR 小鼠肺間質(zhì)纖維化模型的比較[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2010,(4):289-291.

[6]Schrier D J,Kunkel R G,Phan S H.The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Am Rev Respir Dis,1983,127(1):63-66.

[7]何平平,張平,王在巖,等.博來霉素氣管灌注構(gòu)建肺纖維化模型大鼠肺組織低氧誘導(dǎo)因子1α的動態(tài)表達(dá)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,28:5213-5216.

[8]章巍,劉新民,李海潮,等.博來霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織MMP-2、MMP-9、MT1-MMP 及TIMP-1、TIMP-2 的表達(dá)[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2002,(6):716-721.

[9]金曉光,代華平,龐寶森,等.博來霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織的動態(tài)病理變化及其發(fā)生機(jī)制[J].中國病理生理雜志,2009,(4):708-714.

[10]李偉峰,胡玉潔,袁偉鋒,等.氣管內(nèi)滴入與霧化博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,(2):221-225.

[11]王聰,朱繪明,錢衛(wèi)平,等.氣道噴霧博來霉素建立特發(fā)性肺纖維化模型的研究[J].實(shí)用老年醫(yī)學(xué),2013,(9):751-755.

[12]Robbe A,Tassin A,Carpentier J,et al.Intratracheal bleomycin aerosolization:the best route of administration for a scalable and homogeneous pulmonary fibrosis rat model[J]? Bio Med Res Int,2015,198418:doi:10.1155/2015/198418.

[13]周歡.氣管內(nèi)噴霧注入博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型的建立及其評價(jià)[D].重慶:重慶理工大學(xué),2014.

[14]劉珊,范桂香,袁育康,等.兩種小鼠肺纖維化造模方法的比較[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,(3):244-246.

[15]胡萍,高占成.博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的動態(tài)演變及其發(fā)生機(jī)制[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2006,(8):474-478,514.

[16]胡靜,劉旭凌.經(jīng)鼻滴入博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的建立及其病理演變[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2009,(5):351-353.

[17]孟婕,鄒葉強(qiáng).小劑量多次尾靜脈注射博來霉素致小鼠肺纖維化模型的研究[A]//中華醫(yī)學(xué)會，中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會.中華醫(yī)學(xué)會第三屆全國間質(zhì)性肺病暨彌漫性泛細(xì)支氣管炎學(xué)術(shù)會議論文匯編[C].2010:1.

[18]孟婕,彭張哲,陶立堅(jiān).小劑量多次尾靜脈注射與氣管內(nèi)滴注博來霉素致小鼠肺纖維化模型的比較研究[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,(12):1228-1232.

[19]楊聰穎,彭雄群,陽惠湘,等.不同劑量博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的差異及動態(tài)變化[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2013,(2):45-51,94-96.

[20]肖強(qiáng),鄭曉濱,劉香,等.靜脈注射不同劑量博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的比較研究[J].臨床肺科雜志,2015,(2):251-256.

[21]齊曼古麗·吾守爾,夏宇,巴哈爾古麗·米吉提,等.博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的建立方法及比較[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,(6):495-498.

[22]陶章,李惠萍.不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,(7):1214-1218.

[23]左竹林,段生會.百草枯中毒和百草枯肺[J].中國臨床醫(yī)生,2000,28(8):22.

[24]李少巖,李洪洋.百草枯所致大鼠彌漫性肺損傷的病理特點(diǎn)[J].華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1994,25(3):337.

[25]楊珊珊,賈曉民,趙杰,等.三個(gè)品系小鼠百草枯肺纖維化模型的比較[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,(6):456-459.

[26]高燕,雍政,黃英,等.百草枯建立肺纖維化動物模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].空軍總醫(yī)院學(xué)報(bào),2003,(4):18-19.

[27]尹江寧,殷雪平,蔡華忠,等.全肺灌洗對百草枯所致家兔肺纖維化的干預(yù)作用[A]//中華醫(yī)學(xué)會,中華醫(yī)學(xué)會急診醫(yī)學(xué)分會.中華醫(yī)學(xué)會急診醫(yī)學(xué)分會第十六次全國急診醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文集[C].2013:1.

[28]祝春青,陳冬波,王喆,等.腹腔注射百草枯構(gòu)建小鼠肺纖維化模型[J].生物技術(shù)通訊,2012,(4):563-566.

[29]陳石,張德平.實(shí)驗(yàn)性酸吸入致大鼠肺纖維化[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2008,(5):370-375,402-403.

[30]李健,牛建昭,王繼峰,等.AdTGF-β1(223/225)氣管內(nèi)注射制備大鼠肺間質(zhì)纖維化動物模型[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2006,(1):5-7.

[31]單紹臣.金黃色葡萄球菌L型致間質(zhì)性肺炎的實(shí)驗(yàn)動物模型的建立[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2002,(1):27-28.

[32]Moore B B,Hogaboam C M.Murine models of pulmonary fibrosis[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2008,294(2):L152-L160.

[33]余惠明,陸益民.結(jié)締組織疾病早期的肺功能分析[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2001,13(9):438.