基于納米免疫磁珠快速富集4種海洋致病性弧菌的研究＊

張 璇 戴 娟 王祖忠 周 君 張迪駿 張春丹 李 曄 蘇秀榕

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211)

副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticurs)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)和燦爛弧菌(Vibrio splendidus)均屬于革蘭氏陰性、兼性厭氧、嗜鹽性弧菌,主要分布于海水、鹽湖等水域環(huán)境以及魚蝦、蟹貝類等海產(chǎn)品中,是引起海洋生物發(fā)生細(xì)菌性疾病的首要原因(Baker-Austin et al,2010;劉瑞等,2011;趙永剛等,2013;Tanguy et al,2013;高磊等,2014;Sun et al,2014)。目前,直接檢測(cè)海洋中的致病性弧菌,往往由于目標(biāo)菌太少而難以檢測(cè),所以一般都采用先增菌后檢測(cè)的方式,而傳統(tǒng)增菌方法不僅費(fèi)時(shí),且靈敏度低(趙玲等,2013)。為了加快對(duì)以上致病弧菌的檢測(cè)速度及提高檢測(cè)限,采用高效、簡(jiǎn)便的免疫磁珠法對(duì)樣品進(jìn)行分離富集,該法作為一種前處理手段,與其它檢測(cè)方法結(jié)合使用,可大大縮短檢測(cè)時(shí)間,提高檢測(cè)限(蘇晨曦等,2012)。Wang等(2013)用免疫磁分離技術(shù)結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)蘋果汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus spp.),檢測(cè)限為 103CFU/mL,與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比,檢測(cè)時(shí)間縮短了24—40倍。Zeng等(2014)用免疫磁分離與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)生蠔中的副溶血弧菌,在純培養(yǎng)中,檢測(cè)限為 1.4×102CFU/mL,且不受其它菌群的干擾;在生蠔樣品中,檢測(cè)限可達(dá)到1.9—0.19 CFU/g。目前,國(guó)內(nèi)外已有不少學(xué)者利用免疫磁珠快速富集食品中的致病菌,如副溶血弧菌(黃韻儀等,2012;蘇晨曦等,2012)、大腸桿菌O157: H7 (Escherichia coli O157: H7)(Zhu et al,2011;Chen et al,2014;Lin et al,2015)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)(徐金亭等,2012)等,并結(jié)合 ELISA、LAMP、各種 PCR等方法實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)或者多種目標(biāo)菌的定量檢測(cè)(Yang et al,2007;Seo et al,2010;Zeng et al,2014)。

免疫磁珠分離技術(shù)基于抗原抗體間的特異性反應(yīng),高效濃縮目的樣品,且可保留樣品原有的生物活性,有利于后續(xù)檢測(cè),并廣泛應(yīng)用于致病菌檢測(cè)的樣品前期處理(聞一鳴等,2013a,b)。該法可以快速、特異性地從樣品基質(zhì)中富集致病弧菌,解決了傳統(tǒng)致病菌檢測(cè)過程中食品組份復(fù)雜、致病菌難分離、基質(zhì)干擾大等問題(黃韻儀等,2012;王程程等,2013),如海水樣品,只要將海水加到某種特異性免疫磁珠中,就能立即分離富集對(duì)應(yīng)的致病菌,有效對(duì)樣品中的目標(biāo)菌進(jìn)行捕獲,起到富集濃縮的作用,從而減少前期增菌時(shí)間,縮小尋找目的菌范圍,為后續(xù)檢測(cè)減少了工作量(蘇晨曦等,2012)。本研究制備的納米免疫磁珠,可分別實(shí)現(xiàn)對(duì)4種海洋致病性弧菌的快速、特異性富集,這大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度,具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),為更簡(jiǎn)便、快捷地定量檢測(cè)致病弧菌做好了前期準(zhǔn)備,也為開發(fā)4種海洋弧菌免疫磁珠試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

副溶血弧菌(VP)ATCC 17802、創(chuàng)傷弧菌(VV)ATCC 27562、哈維氏弧菌(VH)ATCC 33868、燦爛弧菌(VS)ATCC 33125、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae,EC)ATCC 13047、黃海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi,SM)MCCC 1A02628、鰻弧菌(Vibrio anguillarum,VA)ATCC 43308、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis,SF)ATCC 14506、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda,ET)ATCC 15947購(gòu)于青島日水生物技術(shù)有限公司;4種弧菌抗體、牛血清白蛋白(BSA)、疊氮化鈉(NaN3)購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;納米四氧化三鐵購(gòu)于阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司;3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、25%戊二醛購(gòu)于沃凱化成工業(yè)(上海)有限公司;3M Petrifilm菌落總數(shù)測(cè)試片購(gòu)于美國(guó)3M公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠的制備 將納米四氧化三鐵用APTES氨基化修飾后,再用戊二醛進(jìn)行醛基化處理,然后用PBS清洗3次,最后加PBS重懸,4°C保存?zhèn)溆?何磊等,2008)。取5份1mL醛基化磁珠于1.5mL離心管,磁分離,用PBS清洗3次;分別加入75、150、300、600、1200μg VP多克隆抗體,37°C 于旋轉(zhuǎn)混勻儀中偶聯(lián)2h;置于磁分離器,去液相,用PBS清洗3次;加1mL含0.1% BSA和0.02% NaN3的PBS緩沖液,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀中封閉1h (王程程等,2013);磁分離,去液相,PBS清洗3次;最后加1mL PBS重新分散免疫磁珠,標(biāo)為IMB-VP1—5 (75mg/mL),4°C保存?zhèn)溆?。VH、VV、VS免疫磁珠的制備同上。

1.2.2 抗體加入量的優(yōu)化 將–80°C 保存的菌接種至5mL海水牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,28°C振蕩培養(yǎng)24h,用無菌PBS稀釋菌液濃度。取IMB-VP1—5各3mg于1.5mL離心管,加1mL VP菌懸液,不加免疫磁珠的作為空白對(duì)照,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀中富集 45min,磁分離3min,去液相,用PBS清洗3次。最后將免疫磁珠-菌復(fù)合物重新分散在 1mL PBS中,接種于 3M 試紙,平行3次,28°C培養(yǎng)1—2d,計(jì)算其捕獲率。

捕獲率(capture efficiency,CE)(%)= Nc/N0×100,其中,Nc是免疫磁珠捕獲到的細(xì)菌數(shù),單位為CFU/mL;N0是空白對(duì)照中的細(xì)菌數(shù),單位為CFU/mL。

1.2.3 免疫磁珠量的優(yōu)化 分別取0.75、1.5、3、6、12mg IMB-VP3于1.5mL離心管,加1mL VP菌懸液,不加免疫磁珠的作為空白對(duì)照,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀中富集45min,磁分離3min,其它操作同1.2.2,計(jì)算捕獲率。

1.2.4 免疫反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 取3mg IMB-VP3于1.5mL離心管,加1mL VP菌懸液,不加免疫磁珠的作為空白對(duì)照,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀中分別富集5、15、30、45、60、90min,磁分離3min,其它操作同1.2.2,計(jì)算捕獲率。

1.2.5 免疫磁珠分離時(shí)間的優(yōu)化 取 3mg IMBVP3于1.5mL離心管,加1mL VP菌懸液,不加免疫磁珠的作為空白對(duì)照,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀中富集45min,磁分離分別為0.5、1、3、5、7 min,其它操作同1.2.2,計(jì)算捕獲率。

1.2.6 pH的優(yōu)化 取3mg IMB-VP3于1.5mL離心管,加1mL分別用 pH 6.0、pH 7.4、pH 8.0和 pH 9.6的PBS緩沖液稀釋的VP菌懸液,不加免疫磁珠的作為空白對(duì)照,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀中富集45min,磁分離3min,其它操作同1.2.2,計(jì)算捕獲率。VH、VV、VS免疫磁珠捕獲細(xì)菌條件的優(yōu)化同上。

1.2.7 超微結(jié)構(gòu)觀察 VP、VH、VV和 VS免疫磁珠分別與VP、VH、VV和VS菌體在PBS中結(jié)合,經(jīng)過戊二醛固定以及乙醇梯度脫水后(聞一鳴等,2013a,b),在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察免疫磁珠與其對(duì)應(yīng)致病弧菌的結(jié)合情況。

1.2.8 免疫磁珠的靈敏度檢測(cè) 分別取1mL菌濃度為100—107CFU/mL數(shù)量級(jí)的VP、VV、VH、VS菌懸液,添加3mg IMB-VP3,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育45min,磁分離3min,用PBS清洗3次,最后用1mL PBS重懸。涂3M試紙,重復(fù)3次,28°C培養(yǎng)1—2d,計(jì)算捕獲率。檢測(cè)VV、VH、VS免疫磁珠的靈敏度時(shí)按照各自最佳捕獲條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),具體操作同上。

1.2.9 免疫磁珠的特異性以及抗干擾能力檢測(cè)分別取VP、VV、VH、VS、EC、SF、ET、VA、SM菌液1mL,添加3mg IMB-VP3,37°C于旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育 45min,磁分離 3min,用 PBS清洗3次,最后用1mL PBS重懸。涂3M試紙,重復(fù)3次,28°C培養(yǎng)1—2d,計(jì)算捕獲率。用IMB-VP3對(duì)VP、VV、VS、VH 4種混合菌進(jìn)行捕獲,從而確定 VP免疫磁珠的抗干擾能力。檢測(cè)VV、VH、VS免疫磁珠的特異性以及抗干擾能力操作同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體加入量

當(dāng)VP抗體加入量在75—300μg之間時(shí),捕獲率逐漸增加,當(dāng)加入的抗體量大于300μg時(shí),捕獲率開始下降,最后穩(wěn)定在65%左右。當(dāng)VH抗體加入量在75—600μg之間時(shí),捕獲率逐漸增加,當(dāng)加入的抗體量大于600μg時(shí),捕獲率下降。當(dāng)VV、VS抗體加入量在75—150μg之間時(shí),捕獲率逐漸增加,當(dāng)加入的抗體量大于 150μg時(shí),捕獲率下降。VP免疫磁珠的最佳抗體加入量為300μg,捕獲率為87.5%,VH免疫磁珠的最佳抗體加入量為600μg,捕獲率達(dá)到94.2%,VV和VS免疫磁珠的最佳抗體加入量為150μg,捕獲率分別為98.1%和85.5% (見圖1)。

圖1 抗體加入量對(duì)捕獲率的影響Fig.1 Effect of antibody amount on capture efficiency

2.2 免疫磁珠量

當(dāng)VP、VH免疫磁珠的加入量為0.75—3mg時(shí),VP、VH免疫磁珠的捕獲率逐步上升,分別達(dá)到89.8%和99.1%,當(dāng)加入的免疫磁珠用量大于3mg時(shí),捕獲率會(huì)有所下降。VV免疫磁珠的加入量為 12mg時(shí),捕獲率達(dá)到最高,為98.3%。當(dāng)VS免疫磁珠的加入量為0.75—6mg時(shí),VS免疫磁珠的捕獲率逐步上升,當(dāng)加入的免疫磁珠用量大于 6mg時(shí),捕獲率基本趨于飽和(見圖2)。

圖2 免疫磁珠量對(duì)捕獲率的影響Fig.2 Effect of IMBs (immunomagnetic beads)amount on capture efficiency

2.3 免疫反應(yīng)時(shí)間

免疫反應(yīng)時(shí)間在5—45min內(nèi),VP、VH免疫磁珠的捕獲率逐漸增大,捕獲率分別為 54.9%、63.0%、88.2%、89.1%和 75.2%、90.1%、92.1%、97.5%,說明磁珠與菌液反應(yīng)的時(shí)間越長(zhǎng)效果越好,但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于45min,效果就不明顯。VV、VS免疫磁珠分別在60min、30min時(shí)捕獲率最高(見圖3)。

2.4 免疫磁分離時(shí)間

VP和 VS免疫磁珠在不同免疫磁分離時(shí)間的捕獲效率分別為 57.3%、67.2%、89%、88.5%、85.8%和69.7%、71.5%、85.9%、69.7%、65.9%,捕獲率隨著磁分離時(shí)間延長(zhǎng)到 3min時(shí)達(dá)到最高,時(shí)間再延長(zhǎng)捕獲率反而降低,說明3min為最佳磁分離時(shí)間。VV免疫磁珠在不同免疫磁分離時(shí)間內(nèi)的捕獲率分別為50.5%、58.2%、75.8%、98.9%、96.7%,免疫磁分離時(shí)間在5min時(shí),捕獲率達(dá)到最高。VH免疫磁珠在磁分離1min時(shí)達(dá)到85.9%的最高捕獲率(見圖4)。

圖3 免疫反應(yīng)時(shí)間對(duì)捕獲率的影響Fig.3 Effect of immunoreaction times on capture efficiency

圖4 免疫磁分離時(shí)間對(duì)捕獲率的影響Fig.4 Effect of immunomagnetic separation times on capture efficiency

2.5 緩沖液pH

VP、VS免疫磁珠在pH 7.4的PBS緩沖液中捕獲率最佳,VH免疫磁珠在pH 6.0的PBS緩沖液中捕獲率最佳,VV免疫磁珠在pH 8.0的PBS緩沖液中捕獲率最佳。在pH 9.6的PBS緩沖液中,VP免疫磁珠的捕獲率為0,VS免疫磁珠的捕獲率為12.3%,VH、VV免疫磁珠的捕獲率均低于80%(見圖5)。

2.6 超微結(jié)構(gòu)

裸磁珠大部分顆粒呈現(xiàn)圓形,無不規(guī)則形狀,顆粒大小相對(duì)均一,分散性較好,基本上沒有成堆成團(tuán)的現(xiàn)象(圖6a),可用于制備免疫磁珠。當(dāng)加入抗體后,醛基化磁珠分布在抗體液中,與抗體結(jié)合,開始出現(xiàn)聚集現(xiàn)象(圖6b)。圖6c—圖6f分別表示VP、VH、VV和VS 4種免疫磁珠均能通過其表面的抗體分別與各自的抗原相結(jié)合,且菌體表面結(jié)合磁珠數(shù)量較多。4種弧菌都呈月牙般的弧狀,免疫磁珠仍呈圓形,但大量聚集,一個(gè)菌體表面可與多個(gè)磁珠結(jié)合,從而使磁珠和菌體聚集在一起,呈團(tuán)狀。除VH免疫磁珠較少捕獲到VH外,其余3種免疫磁珠均能大量捕獲對(duì)應(yīng)致病弧菌。

圖5 不同pH緩沖液對(duì)捕獲率的影響Fig.5 Effect of buffer at different pH values on capture efficiency

2.7 靈敏度

在最佳免疫捕獲條件下,VP、VH、VV免疫磁珠分別捕獲100—107CFU/mL數(shù)量級(jí)的VP、VH和VV,結(jié)果如圖7所示,在 101—107CFU/mL濃度下,捕獲率逐漸下降。VS免疫磁珠分別捕獲100—104CFU/mL數(shù)量級(jí)的VS,在101—104CFU/mL濃度下,捕獲率逐漸下降。4種免疫磁珠均可捕獲到100CFU/mL數(shù)量級(jí)的相應(yīng)致病弧菌,表明該免疫磁珠具有較高的靈敏度。

2.8 特異性和抗干擾能力

VP、VH、VV、VS 4種免疫磁珠對(duì)9株菌分別進(jìn)行捕獲。VP免疫磁珠對(duì)VP的捕獲率為87.3%,對(duì)其它菌株的捕獲率均低于 20%。VH、VV、VS免疫磁珠對(duì)其相應(yīng)致病弧菌的捕獲率均達(dá)到 90%以上,VH免疫磁珠對(duì)VV和VS的捕獲率均為18.6%,對(duì)其余菌株的捕獲率均低于15%;VV免疫磁珠對(duì)VS的捕獲率為31.8%,對(duì)其余菌株的捕獲率均低于20%;VS免疫磁珠對(duì)EC的捕獲效率為26%,對(duì)其余菌株的捕獲率均低于 20%。VP、VH、VV、VS 4種免疫磁珠抗干擾能力實(shí)驗(yàn)中,分別對(duì)VP、VV、VS、VH 4種混合菌進(jìn)行捕獲,4種免疫磁珠對(duì)其相應(yīng)致病弧菌的捕獲率均在 90%以上,且不受其它雜菌影響,說明此次制備的免疫磁珠特異性和抗干擾能力較強(qiáng)(見圖8)。

3 討論

圖6 免疫磁珠與致病弧菌結(jié)合的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of pathogenic vibrio interacting with IMBs

用免疫磁珠富集樣品中的目標(biāo)菌,不僅能顯著減少背景細(xì)菌的干擾,還能消除樣品基質(zhì)中的復(fù)雜成分,納米免疫磁珠因其光學(xué)特性、比表面積等優(yōu)勢(shì)而在致病菌檢測(cè)方面受到越來越多的關(guān)注(Leon-Velarde et al,2009;Wadud et al,2010;Wang et al,2013)。首先,隨著磁珠粒徑的減小,細(xì)菌表面可結(jié)合的磁珠數(shù)量增多,在磁分離時(shí)細(xì)菌從免疫磁珠上脫落下來的概率減少,同時(shí),納米磁珠比表面積較微米磁珠大,連接的抗體量更多,彌補(bǔ)了抗體親和力不足的缺點(diǎn),從而使捕獲率增加(Pamme et al,2006)。其次,納米磁珠粒徑小,受布朗熱運(yùn)動(dòng)作用大,在溶液中呈現(xiàn)單分散狀態(tài),加上納米磁珠比表面積大,使得納米磁珠表面上的抗體與抗原接觸概率顯著增加(McCloskey et al,2003a,b)。本研究所采用的是200nm的免疫磁珠,所以在致病菌捕獲率方面較微米磁珠有極大優(yōu)勢(shì),在106—107CFU/mL數(shù)量級(jí)下,VP、VH、VV和VS免疫磁珠分別在最優(yōu)捕獲條件下獲得高達(dá)90%左右的捕獲率,而之前報(bào)道的微米免疫磁珠捕獲致病菌的效率通常在 32%—56%之間(Datt et al,2008)。Yang等(2007)分別用納米磁珠與微米磁珠捕獲單增李斯特菌,結(jié)果顯示,納米磁珠捕獲率是微米磁珠捕獲率的 1.4—26倍,另外,單增李斯特菌濃度越低,納米磁珠捕獲率與微米磁珠捕獲率的差異更顯著。鐘子清等(2013)采用不同粒徑免疫磁珠捕獲單增李斯特菌,結(jié)果顯示180nm、350nm、1180nm的免疫磁珠捕獲細(xì)菌效率分別為95%、18%和9%。但是,免疫磁珠并不是粒徑越小捕獲率就越高。研究表明(王報(bào)貴等,2013),小于50nm的磁珠由于粒徑太小可能會(huì)使目標(biāo)菌死亡,且需要超強(qiáng)磁場(chǎng)和長(zhǎng)時(shí)間的分離,才能有效富集目的菌。本實(shí)驗(yàn)采用平均粒徑為200nm的免疫磁珠,在普通磁力架上 3min左右就可以有效分離致病菌,又由于比表面積大,不僅能與抗體有較多的結(jié)合位點(diǎn),也使其與目標(biāo)菌體表面積接觸機(jī)會(huì)增大,所以捕獲率較其它磁珠更高。即使菌液濃度很低(100CFU/mL數(shù)量級(jí)),磁珠也能捕獲到目標(biāo)菌,即檢測(cè)限高,可達(dá)到2 CFU/mL。靈敏度實(shí)驗(yàn)中,VP、VH、VV和 VS菌液濃度分別為 101、102、100和 101CFU/mL數(shù)量級(jí)時(shí),捕獲率達(dá)到最高,分別為88%、93.5%、94.7%和 100%,且捕獲率隨著菌液濃度的升高而降低,這表明超出反應(yīng)體系中納米免疫磁珠容量后,磁珠捕獲致病菌的數(shù)量不再增加,反而會(huì)受到限制(Zhu et al,2011)。

圖7 免疫磁珠捕獲的靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.7 The sensitivity of the IMBs capture

圖8 免疫磁珠捕獲的特異性實(shí)驗(yàn)Fig.8 The specificity of the capture of IMBs

抗體親和力也會(huì)直接影響免疫磁珠捕獲細(xì)菌的靈敏度,前期試驗(yàn)證明,4種多克隆抗體分別與其對(duì)應(yīng)的菌株具有良好的親和力,所以本實(shí)驗(yàn)4種免疫磁珠具有較高的靈敏度。特異性是評(píng)價(jià)免疫磁分離體系的另一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)中,為了評(píng)價(jià) VP、VH、VV和 VS 4種免疫磁珠的特異性,在 106—107CFU/mL數(shù)量級(jí)濃度下,對(duì)8株非目標(biāo)菌和1株目標(biāo)菌進(jìn)行捕獲,對(duì)目標(biāo)菌的捕獲率分別為 87.3%、90.1%、91.1%和90.5%,對(duì)非目標(biāo)菌的捕獲率除創(chuàng)傷弧菌對(duì)燦爛弧菌的捕獲率在31.8%外,其余均在30%以內(nèi)。4種免疫磁珠能分離出一部分非目標(biāo)菌,原因可能是: (1)本實(shí)驗(yàn)采用的是多克隆抗體,多克隆抗體結(jié)合非目標(biāo)菌的概率大于單克隆抗體;(2)非目標(biāo)菌會(huì)被一些較大的磁顆粒吸附,當(dāng)用磁場(chǎng)分離時(shí),這些被較大的磁性顆粒吸附的非目標(biāo)菌也會(huì)被分離。有研究證明(Zeng et al,2014;Lin et al,2015),微米磁珠比納米磁珠的非特異性吸附強(qiáng),原因是粒徑大的磁珠的總磁力比粒徑小的磁珠的總磁力強(qiáng),在磁分離時(shí)間內(nèi),粒徑大的磁珠更容易將菌(目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌)吸附。所以,本實(shí)驗(yàn)采用200nm的免疫磁珠,其優(yōu)勢(shì)就在于能減少非特異性吸附率。另外,由于免疫反應(yīng)時(shí)間短,清洗次數(shù)多(3—5次),加上本研究制備的納米免疫磁珠最終均用0.1% BSA和0.02% NaN3進(jìn)行封閉,所以實(shí)驗(yàn)獲得的免疫磁珠對(duì)其目標(biāo)菌的捕獲率均在 87%以上,對(duì)非目標(biāo)菌的捕獲率大部分在30%以內(nèi),因?yàn)橛醒芯孔C明(Chen et al,2014),這可以有效增強(qiáng)免疫磁珠與其抗原的特異性結(jié)合,從而減少非特異性吸附。

利用醛基化免疫磁珠對(duì)細(xì)菌進(jìn)行富集,捕獲率受抗體加入量、磁珠用量、免疫反應(yīng)時(shí)間、免疫磁分離時(shí)間、緩沖體系 pH等諸多因素的影響(山珊等,2013;王程程等,2013;謝芳等,2013)?？贵w加入量與免疫磁珠捕獲細(xì)菌的效率呈正相關(guān),但是當(dāng)捕獲率達(dá)到平臺(tái)期后,增加抗體量并不能提高免疫磁珠的捕獲率,有時(shí)候反而會(huì)使捕獲率下降。實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)VP、VH、VV和VS抗體加入量分別為 300、600、150、150μg時(shí),免疫磁珠的捕獲率達(dá)到最高,分別為87.5%、94.2%、98.1%和85.5%,當(dāng)抗體量再增加時(shí),捕獲率或降低或趨于平穩(wěn),導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因是過量的抗體會(huì)使空間發(fā)生阻礙和競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象(黃韻儀等,2012),又由于免疫磁珠捕獲細(xì)菌的整個(gè)過程是在不斷振蕩和洗脫中完成的,這就使得即使較多數(shù)量的抗體與磁珠結(jié)合,但其結(jié)合的穩(wěn)定程度也遠(yuǎn)不如適量抗體和磁珠的結(jié)合,從而使抗體與磁珠分離,導(dǎo)致捕獲率下降(王程程等,2013)。由此可見,抗體加入量過多不僅不能提高捕獲率,還會(huì)造成抗體的浪費(fèi),增加檢測(cè)成本。另外,免疫磁珠的用量也是影響捕獲率的主要因素。在一定范圍內(nèi),磁珠的用量與免疫磁珠捕獲細(xì)菌的效率也呈正相關(guān),但當(dāng)達(dá)到一定捕獲率后,增加磁珠用量并不能顯著提高捕獲率。實(shí)驗(yàn)中,VP、VH、VV和VS免疫磁珠用量分別超過 3、3、12和 6mg時(shí),捕獲率開始下降,該原因是捕獲細(xì)菌需要在強(qiáng)磁場(chǎng)下進(jìn)行,免疫磁珠用量過多,細(xì)菌表面多個(gè)抗原位點(diǎn)與磁珠結(jié)合,分離時(shí)會(huì)造成部分細(xì)菌受損,從而造成捕獲率下降(趙玲等,2013)。除上述兩個(gè)因素,免疫磁珠與細(xì)菌的作用時(shí)間也是影響捕獲率的重要因素之一。隨著免疫反應(yīng)時(shí)間的增加,磁珠的捕獲率也隨之增加,但反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng),反而會(huì)導(dǎo)致捕獲率下降。本實(shí)驗(yàn)中分別研究免疫反應(yīng)時(shí)間在5、15、30、45、60和 90min時(shí)的 4種免疫磁珠的捕獲率情況,結(jié)果顯示,VP、VH、VV和VS分別在45、45、60、30min 時(shí)達(dá)到了 89.1%、97.5%、99.3%、83.3%的最高捕獲率,即免疫反應(yīng)可在30—60min內(nèi)完成,而一般用微米磁珠捕獲致病菌都是在60—120min內(nèi)完成的(Seo et al,2010;Zhu et al,2011),出現(xiàn)這種差異的原因是納米免疫磁珠與靶細(xì)胞結(jié)合時(shí)具有較快的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)表明(Varshney et al,2005),在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面,納米免疫磁珠比1-100μm的磁珠快5—20倍。由于本實(shí)驗(yàn)采用的是納米免疫磁珠,所以免疫反應(yīng)時(shí)間較短。免疫反應(yīng)一般是在pH 6.0—8.0之間進(jìn)行,pH過低或者過高都可能影響抗體抗原的結(jié)合(劉偉偉等,2011;聞一鳴等,2013a,b)。pH過低會(huì)使抗體抗原解離,免疫磁珠捕獲細(xì)菌效率降低;pH過高會(huì)使蛋白質(zhì)破壞或者變性,抗體抗原無法結(jié)合,從而使捕獲率下降,甚至出現(xiàn)零捕獲,比如VP免疫磁珠在pH 9.6的時(shí)候,捕獲率為 0。所以在免疫反應(yīng)過程中,選擇一個(gè)合適的pH是相當(dāng)重要的。

免疫磁珠可直接從樣品中捕獲目標(biāo)菌,解決了其它菌群的干擾和抑制問題,所以在抗干擾性實(shí)驗(yàn)中,加入其它菌群并不影響免疫磁珠對(duì)其靶細(xì)菌的富集。此外,免疫磁分離技術(shù)結(jié)合其它快速檢測(cè)方法,可大大縮短檢測(cè)時(shí)間,提高特異性和靈敏度。若用于實(shí)際食品檢測(cè)中,可將待檢樣品富集濃縮,這將大大提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度,具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),該檢測(cè)方法對(duì)于食品(瘦肉精的磁珠富集)安全的篩查、診斷、治療、監(jiān)測(cè)和控制等也都具有重要的意義。

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