長牡蠣(Crassostrea gigas)微衛(wèi)星多重PCR體系構建及其在家系鑒定中的應用＊

紀仁平 李煥軍 馮艷微 張榮良 王衛(wèi)軍① 楊建敏①

(1.上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306;2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006)

長牡蠣(Crassostrea gigas),地方名蠔、蠣黃、海蠣子、蚵等,屬于珍珠貝目、牡蠣科、巨蠣屬。長牡蠣自然分布于西太平洋海域,是一種廣溫、廣鹽性貝類。牡蠣因其肉質鮮美,營養(yǎng)豐富,環(huán)境適應性強,生長快速,而成為我國乃至全世界養(yǎng)殖產量最大的一種經濟貝類。近幾年長牡蠣的養(yǎng)殖規(guī)模越來越大,產量也大幅度提高,但其種質卻出現(xiàn)明顯的退化。因此,良種選育是我國長牡蠣養(yǎng)殖產業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展亟待解決的問題,而微衛(wèi)星分子標記技術可為長牡蠣群體遺傳多樣性分析和家系親權鑒定等方面的研究提供技術支持。

在水產動物研究領域,微衛(wèi)星標記因其具有高多態(tài)性,共顯性遺傳等特點,已在分子標記輔助育種和家系分析等方面得到廣泛的應用。20世紀80年代,Chamberlain等(1988)首次嘗試了多重PCR反應模式,即在同一 PCR反應體系中加入多對微衛(wèi)星引物,同時進行多個目標序列的擴增分析。多重 PCR技術具有省時高效、高通量、低成本等優(yōu)點,且可有效減少靶基因片段的假陽性現(xiàn)象,檢驗效率得到明顯提高(羅偉等,2013)。因此,微衛(wèi)星多重PCR為水生生物親權關系分析(Lerceteau-K?hler et al,2006)、種質鑒定(王婷等,2013)、群體遺傳分析(Li et al,2007)、遺傳分離模式分析(聶鴻濤等,2013)等研究提供了有力的工具。目前關于長牡蠣微衛(wèi)星多重PCR已有報道,但一般都是三重或四重微衛(wèi)星PCR反應體系(Li et al,2010;Taris et al,2005)。本研究從已報道的長牡蠣微衛(wèi)星中開發(fā)出了兩組微衛(wèi)星五重 PCR反應體系,并在2012年構建的0527組和0612組的各27個全同胞家系的親權鑒定中得以應用。

1 材料與方法

1.1 家系樣品的構建

本實驗家系材料的構建于2012年5月27日(記為0527組)和6月12日(記為0612組)在山東省煙臺海 益 苗 業(yè) 有 限 公 司 萊 州 育 苗 場 (LZ,37°26′1″N,120°02′15″E)進行。實驗所用親貝為經過四代選育的中日韓三個群體。每個群體分別選取3個父本和3個母本個體作為親貝,0527組和0612組都采用表1所示的部分因子實驗設計的方式分別建立27個全同胞家系;當各家系發(fā)育至D形幼蟲期時,計密度并將各家系幼蟲等量混合,然后進行混合培育。取 0527組和0612組各18個親本的閉殼肌保存于70%乙醇中用于DNA的提取。

表1 27個長牡蠣全同胞家系的構建Tab.1 The construction for 27 full-sib families of the Pacific oyster

1.2 樣品采集及DNA提取

當養(yǎng)成至560日齡時,對兩個實驗組進行取樣。隨機選取0527組653個子代和0612組382個子代個體的閉殼肌保存于 70%乙醇中用于提取 DNA。各實驗組子代和親本基因組DNA的提取按照Li等(2002)氯仿/異戊醇法,通過分光光度計和1%瓊脂糖凝膠檢測 DNA樣品的濃度和純度,并將 DNA濃度調至30ng/μL,–20°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 長牡蠣微衛(wèi)星位點的篩選

從已開發(fā)的長牡蠣微衛(wèi)星中,根據(jù)微衛(wèi)星位點的多態(tài)性、序列重復單位、連鎖信息,以及擴增效果等篩選出 43個位點(Li et al,2003;Sauvage et al,2009)。微衛(wèi)星引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。每個位點最佳PCR擴增條件用10個個體檢測。以引物的多態(tài)性,條帶大小及清晰程度,擴增效率等作為篩選條件,挑選出擴增效果最好的 10個微衛(wèi)星位點用于多重PCR的開發(fā),ucdCg149,ucdCg109,ucdCg140,ucdCg181,ucdCg170,ucdCg112,ucdCg129,ucdCg134,ucdCg162,ucdCg151 (Li et al,2003)和CGSILI39 (Sauvage et al,2009)(表2)。將10個位點分為兩組,每組中用四種顏色的熒光標記(HEX,FAM,ROX和TAMRA),構成兩組微衛(wèi)星五重PCR反應體系(Multiplex Set 1,MS 1;Multiplex Set 2,MS 2)。

1.4 PCR產物檢測

PCR擴增產物與高度去離子甲酰胺(HIDI)和分子量內標GeneScan ROX500/ LIZ500 (美國ABI公司)以產品說明中要求的比例進行混合,變性 5min后迅速冷卻,于3730 XL測序列分析儀(美國ABI公司)上進行檢測分析。用 Genemapper v.3.7軟件(美國Applied Biosystems公司)分析DNA片段大小。

1.5 微衛(wèi)星標記優(yōu)化組合

根據(jù)適于同時擴增的位點最大化且同一熒光標記的位點間等位基因不重疊的原則(Li et al,2010)將這些位點進行五重 PCR組合。通過對退火溫度、反應體系、循環(huán)參數(shù)(退火溫度,延伸時間)等條件進行優(yōu)化,確定五重PCR的最佳反應條件。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

首先運行CERVUS 3.0 (Kalinowski et al,2007)軟件中的模擬功能估算兩組長牡蠣家系鑒定所需要的位點數(shù)及其鑒定效率。軟件操作具體參數(shù)設置如下:模擬子代數(shù)目設置為10000 (循環(huán)重復數(shù)),父母本數(shù)根據(jù)軟件要求均為實際父母本數(shù)設為 9,親本檢測率設置為 100%,位點檢測率為 100%,分型誤差率為1%,置信區(qū)間設置為95%,親本性別已知。家系鑒定運用CERVUS 3.0中基于似然性的計算方法從非排除親本中選擇最可能的親本。

同時也采用CERVUS 3.0對各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Number of alleles,Na),多態(tài)信息含量(Polymorphism Information Content,PIC)和位點的非排除能力(NE-1P,NE-2P,NE-PP)進行統(tǒng)計分析。親本對子代的貢獻差異由SPSS 14.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行非參數(shù)卡方檢驗。

表2 用于多重PCR體系構建的微衛(wèi)星位點的基本信息Tab.2 Information of the SSR loci for establishment of multiplex PCR system

2 結果

2.1 五重PCR的優(yōu)化

設計的引物組合經過篩選優(yōu)化后獲得了兩組微衛(wèi)星五重PCR體系。

兩組五重 PCR反應體系 25μL包括: 模板 DNA 1.0μL (30ng),10×PCR Buffer 2.5μL,25mmol/L MgCl22.0μL,10mmol/L dNTPs 0.5μL,10mmol/L引物每對各0.2μL,5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.2μL,純水 17.8μL。

兩組五重 PCR反應程序均為: 95°C預變性3min;95°C變性 30s,退火溫度 60°C 30s,72°C延伸30s,循環(huán) 10次;95°C變性 30s,退火溫度 55°C 30s,72°C延伸 30s,循環(huán) 20次;最后 72°C 延伸 6min;4°C 保存。

各體系的引物組合、引物濃度詳見表3、表4。部分微衛(wèi)星五重PCR的毛細管電泳結果如圖1。

圖1 微衛(wèi)星五重PCR的毛細管電泳圖譜Fig.1 The capillary electrophoresis amplified by SSR 5-multiplex PCR

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 0527實驗組 10個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Na)范圍從19到36,平均值為28.8,位點平均多態(tài)信息含量為 0.8924,反映了這兩組五重 PCR在家系鑒定中具有較高的排除能力。兩組五重 PCR的觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)范圍為 0.426—0.811,平均觀測雜合度為 0.6519,期望雜合度(Expected heterozygosity,He)范圍為 0.870—0.931,平均期望雜合度為 0.9011,無效等位基因頻率為5.9%—36.3% (表 3)。

表3 0527組長牡蠣中兩組微衛(wèi)星五重PCR的特征Tab.3 Characteristics of two SSR 5-multiplex PCRs in the Pacific oyster of group 0527

2.2.2 0612實驗組 經篩選后得到10個微衛(wèi)星位點(表4)。每個位點的等位基因數(shù)(Na)為15—31,平均值為 23.7;觀測雜合度(Ho)為 0.376—0.845,平均觀測雜合度為 0.5588;期望雜合度(He)為 0.712—0.933,平均期望雜合度為0.8652;位點平均多態(tài)信息含量為0.8516;無效等位基因頻率為7.7%—41.4%。

表4 0612組長牡蠣中兩組微衛(wèi)星五重PCR的特征Tab.4 Characteristics of two SSR 5-multiplex PCRs of group 0612 in the Pacific oyster

2.3 微衛(wèi)星五重PCR在家系鑒定中的應用

2.3.1 0527實驗組 使用兩組微衛(wèi)星五重PCR對27個家系的 653個個體進行了親子鑒定,經用CERVUS 3.0軟件進行分析,使用這兩組微衛(wèi)星五重PCR的親子鑒定成功率為100%;只用MS 1,可以將96%的子代鑒定到親本;只用第二組 MS 2,可以將97%的子代鑒定到親本。

對653個長牡蠣子代個體進行基因分型,將其全部成功分配至唯一親本對,子代在 27個全同胞家系中的分布情況見表 5。家系間子代數(shù)目差異非常大,家系F23 (♀8×♂8)有72個子代,占子代總數(shù)的11.0%;而家系 F04 (♀2×♂2)僅有 1個子代,占子代總數(shù)的0.2%。通過卡方檢驗可知,父本(χ2=148.02,P=0.00)和母本(χ2=208.55,P=0.00)對子代的貢獻率有顯著性差異: 母本產生的子代數(shù)最多為 137個(♀8),貢獻率為21.0%;最少的為7個(♀2),貢獻率為1.1%。父本產生的子代數(shù)最多的為117個(♂9),貢獻率為17.9%;最少為27個(♂2),貢獻率為4.1%(表5)。

2.3.2 0612實驗組 使用兩組微衛(wèi)星五重PCR對0612組27個全同胞家系382個個體進行親子鑒定的準確率為100%;只用MS 1,親子鑒定準確率為96%;只用MS 2,可以將95%的子代鑒定到親本。

表6為0612組382個長牡蠣子代個體在27個全同胞家系中的分布情況。子代在建立的 27個家系中呈現(xiàn)不均等分布。不同家系間的子代數(shù)有較大差異,從 1 (F27,♀9×♂9)到 68 (F25,♀9×♂1)不等?？ǚ綑z驗結果顯示,母本(χ2=119.86,P=0.00)和父本(χ2=142.88,P=0.00)對子代的貢獻率有顯著性差異: 母本產生的子代數(shù)最多和最少分別為80 (♀9)和9 (♀3),貢獻率分別為 20.9%和 2.4%;父本產生的子代數(shù)最多和最少分別為93 (♂1)和14 (♂9),貢獻率分別為24.3%和3.7%。

表5 0527組中27個長牡蠣全同胞家系的653個個體的親權分析Tab.5 Parentage assignment of 653 offspring from 27 full-sib families of group 0527 in the Pacific oyster

3 討論

3.1 微衛(wèi)星多重PCR無效等位基因

微衛(wèi)星中位點的突變、插入或缺失是無效等位基因產生的主要原因(Callen et al,1993;Pemberton et al,1995)。無效等位基因的出現(xiàn)是降低家系分析準確率的主要來源之一(Marshall et al,1998),但并不影響其在家系分析研究中的應用(Li et al,2005)。通過增加微衛(wèi)星位點數(shù)和避免使用無效等位基因頻率過高的微衛(wèi)星位點可提高微衛(wèi)星位點的家系鑒定能力(Carlsson,2008;Wang et al,2010)。McGoldrick等(2000)曾報道太平洋牡蠣中無效等位基因頻率為20%。Li等(2003)發(fā)現(xiàn)長牡蠣中 51.9%的微衛(wèi)星位點含有無效等位基因。Hubert等(2004)也報道了在長牡蠣中無效等位基因較高,達51.0%。本實驗的10個微衛(wèi)星位點在0527組的27個全同胞家系鑒定中的無效等位基因頻率為5.9%—36.3%,而在0612組的27個全同胞家系鑒定中無效等位基因頻率為 7.7%—41.4%。

表6 0612組中27個長牡蠣全同胞家系的382個個體的親權分析Tab.6 The parentage assignment of 382 offspring from 27 full-sib families of group 0612 in Pacific oyster

3.2 微衛(wèi)星多重PCR在家系鑒定中的應用

微衛(wèi)星多重 PCR技術已應用于多種水生動物的家系鑒定分析。聶鴻濤等(2013)用12個微衛(wèi)星位點對12個皺紋盤鮑全同胞家系的 372個子代進行家系鑒定,兩組多態(tài)信息含量最高的多重 PCR的鑒定成功率分別為90%和86%,在此基礎上增加任意一個多重PCR組合,即可達到 100%的鑒定成功率。李佳凱等(2014)建立了大黃魚微衛(wèi)星多重PCR體系,使用3組微衛(wèi)星多重PCR體系進行親子鑒定準確率為100%。苗貴東等(2011)對大菱鲆7個人工選育家系進行了親子鑒定,已知1個親本時兩組多重PCR的鑒定成功率為 96.42%,在雙親未知的情況下親子鑒定準確率為96.58%。Li等(2010)使用兩組多態(tài)信息含量最高的微衛(wèi)星多重PCR對12個單對交配長牡蠣家系進行基因分析,達到100%的鑒定成功率。

在本試驗中,用兩組微衛(wèi)星五重 PCR鑒別時,在0527組和0612組的鑒定成功率均為100%;只用MS 1,可以將0527組96%的子代和0612組96%的子代鑒定到親本;只用MS 2,可以將0527組97%的子代和0612組95%的子代鑒定到親本。本研究中較高的家系鑒定成功率可能與所使用的微衛(wèi)星位點較好及其多態(tài)性水平較高有關,這與 Gheyas等(2009)所提到的選擇更多信息量大、多態(tài)性高的位點是達到高鑒定率的必要保障的觀點相一致。

作者僅用兩組微衛(wèi)星五重 PCR反應體系就完成了 10個微衛(wèi)星位點的分型,在短時間內實現(xiàn)長牡蠣群體的遺傳多樣性分析,充分體現(xiàn)了多重 PCR快速高效、高通量、節(jié)約、簡便的特點。本研究中篩選出的微衛(wèi)星多重 PCR體系不僅可以應用于長牡蠣群體的親子鑒定分析以及分子標記輔助育種,還可為家系群體遺傳多樣性分析和遺傳關系研究等方面的研究提供技術基礎。

王 婷,徐 燕,陳昌生等,2013.基于 SCAR標記的壇紫菜“閩豐 1號”多重 PCR鑒定技術的建立.水產學報,37(5):688—695

李佳凱,王志勇,韋信鍵等,2014.大黃魚微衛(wèi)星多重PCR體系的建立及其應用.水產學報,38(4): 470—475

羅 偉,高澤霞,曾 聰?shù)?2013.團頭魴微衛(wèi)星多重PCR體系的建立及應用.大連海洋學學報,28(5): 418—423

苗貴東,杜 民,楊景峰等,2011.大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR技術建立及應用.中國海洋大學學報,41(1—2):97—106

聶鴻濤,李 琪,孔令鋒,2013.皺紋盤鮑微衛(wèi)星多重PCR體系構建及其在家系鑒定中的應用.水產學報,37(2): 207—215

Callen D F,Thompson A D,Shen Y et al,1993.Incidence and origin of “null” alleles in the (AC)nmicrosatellite markers.Am J Human Genet,52(5): 922—927

Carlsson J,2008.Effects of microsatellite null alleles on assignment testing.J Hered,99(6): 616—623

Chamberlain J S,Gibbs R A,Rainer J E et al,1988.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification.Nucl Acids Res,16(23):11141—11156

Gheyas A A,Woolliams J A,Taggart J B et al,2009.Heritability estimation of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)harvest traits using microsatellite based parentage assignment.Aquaculture,294(3—4): 187—193

Hubert S,Hedgecock D,2004.Linkage maps of microsatellite DNA markers for the Pacific oyster Crassostrea gigas.Genetics,168(1): 351—362

Kalinowski S T,Taper M L,Marshall T C,2007.Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment.Mol Ecol,16(5): 1099—1106

Lerceteau-K?hler E,Weiss S,2006.Development of a multiplex PCR microsatellite assay in brown trout Salmo trutta,and its potential application for the genus.Aquaculture,258(1—4):641—645

Li G,Hubert S,Bucklin K et al,2003.Characterization of 79 microsatellite DNA markers in the Pacific oyster Crassostrea gigas.Mol Ecol Notes,3(2): 228—232

Li Q,Kijima A,2005.Segregation of microsatellite alleles in gynogenetic diploid Pacific abalone (Haliotis discus hannai).Mar Biotechnol,7(6): 669—676

Li Q,Park C,Kijima A,2002.Isolation and characterization of microsatellite loci in the Pacific abalone,Haliotis discus hannai.J Shellfish Res,21: 811—815

Li Q,Park C,Kobayashi T et al,2003.Inheritance of microsatellite DNA markers in the Pacific abalone Haliotis discus hannai.Mar Biotechnol,5(4): 331—338

Li R H,Li Q,Cornette F et al,2010.Development of four EST-SSR multiplex PCRs in the Pacific oyster (Crassostrea gigas)and their validation in parentage assignment.Aquaculture,310(1—2): 234—239

Li Y T,Wongprasert K,Shekhar M et al,2007.Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations.Aquaculture,266(1—4): 279—288

Marshall T C,Slate J,Kruuk L E B et al,1998.Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations.Mol Ecol,7(5): 639—655

McGoldrick D,Hedgecock D,English L J et al,2000.The transmission of microsatellite alleles in Australian and North American stocks of the Pacific oyster (Crassostrea gigas):selection and null alleles.J Shellfish Res,19: 779—788

Pemberton J M,Slate J,Bancroft D R et al,1995.Nonamplifying alleles at microsatellite loci: a caution for parentage and population studies.Mol Ecol,4(2): 249—252

Sauvage C,Boudry P,Lapègue S,2009.Identification and characterization of 18 novel polymorphic microsatellite makers derived from expressed sequence tags in the Pacific oyster Crassostrea gigas.Mol Ecol Res,9(3): 853—855

Taris N,Baron S,Sharbel T F et al,2005.A combined microsatellite multiplexing and boiling DNA extraction method for high-throughput parentage analyses in the Pacific Oyster (Crassostrea gigas).Aquac Res,36(5): 516—518

Wang Y,Wang X X,Wan A M et al,2010.A 16-microsatellite multiplex assay for parentage assignment in the eastern oyster (Crassostrea virginica Gmelin).Aquaculture,308(1):S28—S33