一例母麝因打斗造成死亡的鑒定

竭 航，封孝蘭，曾德軍，陳 強(qiáng)，張承露，舒 剛，趙貴軍*

(1.重慶市藥物種植研究所藥用動(dòng)物研究室，重慶 南川 408435;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

林麝屬于國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，被列入《瀕臨滅絕野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約》和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》，主要產(chǎn)品麝香是珍貴的中藥和香料［1，2］，目前全國(guó)人工養(yǎng)殖的林麝數(shù)量?jī)H6 000余頭［3］。林麝數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，其中很重要的一個(gè)原因是林麝尚未完全馴化，野性較強(qiáng)。付聰［4］研究表明，雄性林麝常常因?yàn)闋?zhēng)奪配偶和食物而發(fā)生打斗，輕者造成外傷感染，重者甚至發(fā)生死亡。因此，雄性林麝之間的打斗已引起人們的關(guān)注。而母麝因爭(zhēng)偶而打斗也會(huì)給養(yǎng)殖戶造成重大損失，本研究就1例母麝因爭(zhēng)奪配偶打斗引起癱瘓，最終因形成化膿型竇道而死亡的病例鑒定進(jìn)行報(bào)道，以期為減少林麝養(yǎng)殖戶的損失提供參考。

1 發(fā)病情況

2013年11月，某養(yǎng)殖場(chǎng)2頭成年母麝由于爭(zhēng)偶而發(fā)生打斗，體質(zhì)較弱的母麝發(fā)生開放性創(chuàng)口和后肢癱瘓。養(yǎng)殖場(chǎng)立刻將受傷的母麝隔離單獨(dú)飼喂，用碘酒進(jìn)行傷口消毒并敷消炎粉處理，配合抗生素進(jìn)行全身治療。受傷母麝開始階段采食情況正常，精神未見異常，但移動(dòng)時(shí)后肢只能在地上拖行。2014年8月12日開始出現(xiàn)采食量下降，精神萎靡的癥狀，于8月16日死亡。

2 病理變化

剖解可見死亡母麝被毛凌亂，尸僵不全，后肢嚴(yán)重潰爛，肛門處已經(jīng)完全化膿腐爛成為竇道，化膿灶上布滿蛆，散發(fā)惡臭;肺部有明顯出血點(diǎn)(見圖1);肝臟腫大，比正常顏色較深;脾臟腫脹。

圖1 死亡林麝解剖情況

3 病理組織切片

無菌采集死亡林麝的心、肝、脾、肺、腎病灶部位，置于10%福爾馬林中固定。待福爾馬林完全滲入病灶組織后，將樣品送到四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病理切片的制作。實(shí)驗(yàn)采用HE染色法。

4 病原微生物鑒定

4.1 病原菌分離培養(yǎng) 無菌采集心、肝、脾、肺、腎的病變部位和膿腫病灶與周圍組織交界處組織，迅速保存于 -20℃冰箱中。按照方法［5］將病樣用無菌生理鹽水稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。分別接種于S.S平板培養(yǎng)基、麥康凱平板培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基(鄭州博賽生物有限公司生產(chǎn))，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色和顯微鏡檢，初步確定各培養(yǎng)基上細(xì)菌生長(zhǎng)的種類和數(shù)量。

4.2 16S rRNA測(cè)序分析［5］挑取數(shù)個(gè)菌落懸浮于含50 μL超純水的小試管中，振蕩混勻，用PCR儀95℃加熱10 min，置于冰上冷卻15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液作為PCR反應(yīng)的粗制DNA模板，置-20℃保存?zhèn)溆?。采用?xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為:10×Taq Buffer 5 μL，Mg2+3 μL，2.5 μmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，無菌水30.5 μL，模板 5 μL，共 50 μL。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，49℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10 min，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。由上海生工貿(mào)易有限公司測(cè)序，序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)判斷細(xì)菌的種類。

5 結(jié)果與分析

5.1 病理切片觀察結(jié)果

5.1.1 心臟:結(jié)構(gòu)均勻，心肌纖維完整，形態(tài)正常(見圖2)。

圖2 死亡林麝心肌纖維完整，形態(tài)正常(H.E.400×)

5.1.2 肝臟:肝臟中央靜脈溶血、瘀血，肝索間隙增寬(見圖3A，箭頭所指為增寬的肝索間隙和中央靜脈瘀血);肝索腫脹、溶解，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿顆粒變性(見圖3B，箭頭所指為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn))。

圖3 肝臟的病理切片觀察結(jié)果

5.1.3 脾臟:脾臟被膜有壞死灶，脾小動(dòng)脈出血(見圖4)。

圖4 脾臟被膜壞死，脾小動(dòng)脈出血(H.E.400×)

5.1.4 肺臟:肺泡間質(zhì)細(xì)胞腫脹、融合，結(jié)締組織增生、瘀血(見圖5A，箭頭所指為腫脹的間質(zhì)細(xì)胞);肺泡間炎癥細(xì)胞增生，含鐵血黃素出血，靜脈瘀血，炎癥細(xì)胞增多(見圖5B，箭頭所指為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn))。

圖5 肺臟的病理切片觀察結(jié)果

5.1.5 腎臟:腎小球瘀血，腎小管出血、瘀血(見圖6A，箭頭所指為瘀血的腎小球);腎小管間隙消失、腫脹;腎小管炎性細(xì)胞浸潤(rùn);腎小球腫脹(見圖6B，箭頭所指為腎小管炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球腫脹)。

圖6 腎臟的病理切片觀察結(jié)果

5.2 病原微生物分離與鑒定結(jié)果

5.2.1 在死亡林麝化膿病灶處及心、肝、脾、肺、腎組織中均分離到2種細(xì)菌，一種在血平板培養(yǎng)基上為白色針尖大小，β溶血，革蘭氏染色呈陽性，形態(tài)呈棒狀或桿狀，單在或成叢存在;在巧克力培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。另外一種細(xì)菌在S.S平板培養(yǎng)基和麥康凱平板培養(yǎng)基上不生長(zhǎng);在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在血平板上也可生長(zhǎng)，菌落表面光滑、濕潤(rùn)、隆起。

5.2.2 通過細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后在GenBank中比對(duì)結(jié)果表明，分離得到的2種細(xì)菌分別為化膿隱秘桿菌和葡萄球菌。

6 討論

6.1 化膿性疾病是林麝的常見疾病，也是引起林麝死亡的最主要原因［5～7］。引起林麝化膿的病原較多，付文龍等［8］從林麝喉頭后側(cè)深部膿腫中分離出葡萄球菌。羅燕等［9］從化膿性病變的組織器官中分離到大腸埃希氏菌、沙門氏菌、綠膿桿菌和葡萄球菌等。趙克雷等［5］研究表明，28例林麝膿腫病原更為復(fù)雜，主要包括化膿隱秘桿菌、綠膿桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌等12種細(xì)菌。本研究在病變組織中檢出化膿隱秘桿菌和葡萄球菌，病原的種類包括在上述研究結(jié)果中，說明化膿隱秘桿菌和葡萄球菌的分布較廣，從華東到四川和重慶均有分布，它們作為條件性致病菌、化膿性疾病的原因常常是因?yàn)榄h(huán)境消毒不徹底，在林麝相互打斗或者其他因素(如樹枝劃傷)引起外傷或者抵抗力下降的情況下入侵林麝機(jī)體而發(fā)病。

6.2 林麝是尚未完全馴化的動(dòng)物，其野性依然存在，雄性林麝之間常常為了爭(zhēng)奪食物和配偶打斗，輕者造成外傷感染，重者死亡。劉春燕等［10］研究表明，上海某養(yǎng)麝場(chǎng)12只林麝死亡病例中，有7例因?yàn)榇蚣馨l(fā)生外傷感染，最后造成死亡。在本研究中，母麝因爭(zhēng)奪配偶而發(fā)生打斗，受傷癱瘓，最后形成化膿型竇道而死亡。因此，在配種期應(yīng)加強(qiáng)對(duì)林麝的監(jiān)控，建立健全值班制度，以防公、母麝之間打斗而引起不必要的損失。

7 小結(jié)

為了減少林麝化膿性疾病的危害，應(yīng)建立定期消毒制度，盡量殺滅環(huán)境中的條件性致病菌。同時(shí)，及時(shí)處理林麝圈中可能給林麝帶來傷害的尖銳物品，如折斷的樹枝、鐵絲、鐵釘?shù)?。最重要的是?yīng)加強(qiáng)林麝的馴化與管理，防止林麝因打斗造成損傷，一旦發(fā)生打斗，應(yīng)馬上將其隔離，并及時(shí)用藥物對(duì)受傷林麝進(jìn)行救治，防止林麝死亡事件的發(fā)生。

［1］ Goh C L，Kwok S F.A simple method of qualitative analysis for musk ambrette，musk ketone and musk xylene in cologne［J］.Contact Dermatitis，1986，14(1):53.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.361.

［3］ 李林海，黃祥云，劉剛，等.我國(guó)麝養(yǎng)殖種群現(xiàn)狀及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的分析［J］.四川動(dòng)物，2012，31(3):492.

［4］ 付聰.圈養(yǎng)馬麝社群沖突和等級(jí)地位［D］.北京:中央民族大學(xué)生態(tài)學(xué)，2010.

［5］ 趙克雷，李旭鑫，帕哈爾定·帕拉哈提，等.圈養(yǎng)林麝膿腫病病原菌分離鑒定及藥敏分析［J］.四川動(dòng)物，2011，30(4):522 ～526.

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［10］ 劉春燕.林麝Moschus berezovsikii養(yǎng)殖種群死亡原因及其生命生理特征研究［D］.上海:華東師范大學(xué)生態(tài)學(xué)，2008.