苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Gp64基因的原核表達(dá)

張佑紅，熊瑤，周鋒，徐智鵬，諶頡，陳杏洲

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Gp64基因的原核表達(dá)

張佑紅1，2，熊瑤1，2，周鋒1，2，徐智鵬1，2，諶頡1，2，陳杏洲1，2

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒囊膜蛋白Gp64是桿狀病毒感染宿主細(xì)胞的重要功能蛋白之一.通過(guò)Oligo6．0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增Gp64基因的部分DNA片段，對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到的DNA片段進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的雙酶切DNA片段與經(jīng)同尾酶雙酶切后的原核表達(dá)載體pET28a進(jìn)行連接；對(duì)捕獲有重組質(zhì)粒pET28a－Gp64的大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)，通過(guò)SDS－PAGE對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果表明擴(kuò)增的目的片段獲得了表達(dá)；采用電透析的方法純化了該蛋白，為進(jìn)一步制備抗Gp64蛋白抗體做準(zhǔn)備.

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒；Gp64蛋白；Gp64基因；表達(dá)；純化

0 引言

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）是桿狀病毒科核型多角體病毒屬的典型代表，該病毒的基因組為134 kb的環(huán)狀單一雙鏈DNA分子.由于AcMNPV DNA含有大量多克隆序列，這些序列不是病毒DNA復(fù)制所必需的，能容許基因缺失或替換，故常用作外源基因的表達(dá)載體［1－3］.AcM NPVC在感染宿主后有非包涵體病毒（BV）和包涵體病毒（OV）兩種表現(xiàn)型［4－5］.Gp64蛋白是BV的重要組成部分，由512個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子量約為64 kD.Gp64蛋白是第三類過(guò)濾性的膜融合蛋白，主要以二硫鍵相連的三聚體形式存在于桿狀病毒BV顆粒的一端，GP64基因是桿狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因中唯一既有早期啟動(dòng)子又有晚期啟動(dòng)子的基因，是病毒通過(guò)吸附、包吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵功能蛋白基因之一［6－7］，在病毒吸附內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程中，依賴環(huán)境中的酸性pH，通過(guò)與膜融合使病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞［8］.本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增AcMNPV Gp64基因中長(zhǎng)度為963 bp的DNA片段，利用軟件計(jì)算其編碼的蛋白質(zhì)分子量約40 kD，將該基因克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)中并成功表達(dá)截短的Gp64基因，用透析袋電洗脫法對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，獲得較純凈的Gp64蛋白，利用該蛋白進(jìn)行大白兔免疫實(shí)驗(yàn)制備抗Gp64蛋白抗體［9］.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

大腸桿菌質(zhì)粒pET28a由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院提供，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcMNPV Bacmid由南陽(yáng)理工師范學(xué)院提供，大腸桿菌BL21（DE3）和克隆型DH10B菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存.

實(shí)驗(yàn)過(guò)程所需要的限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，DNA、蛋白質(zhì)Marker以及pGEM－T Easy Vector（T載體）均購(gòu)自寶生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 有AcMVPV Bacmid全基因組提取具體AcMVPV Bacmid DNA抽提方法參見(jiàn)Guide to BEVS and Insert cell culture Techniques.

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR根據(jù)在NCBI上面搜索出的1500 bp大小Gp64基因的DNA序列，去掉其跨膜區(qū)域周圍約500個(gè)堿基.利用DNAman分析其酶切位點(diǎn)，通過(guò)Oligo6．0設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物兩端分別添加EcoR I和Sal I限制酶切位點(diǎn)，由武漢安基生物公司合成：上游引物為5’－CGGAATTCGTAAGCGCTATTGTTTTA－3；下游引物為：5’－CGCGTCGACTTAAATGTTCATTTTCAGCAA－3＇.用實(shí)驗(yàn)室保存的菌種提取的AcMNPV Bacmid質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR合成Gp64基因，擴(kuò)增的目的片段大小為963 bp.DNA變性溫度為95℃3 min；PCR共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)：94℃1min，50℃1min，72℃1 min，最后再在72℃進(jìn)行延伸反應(yīng)10 min，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 Gp64基因表達(dá)載體的構(gòu)建將特異性片段進(jìn)行Ta克隆，驗(yàn)證得到的正確克隆產(chǎn)物進(jìn)行SalI和EcoRI雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化后與經(jīng)過(guò)XholI、EcoRI雙酶切和凝膠回收的原核表達(dá)載體pET28a進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH10B感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行鑒定，包括菌PCR檢測(cè)，酶切驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)目的重組質(zhì)粒命名為pET28a－Gp64［10］.其中DNA純化過(guò)程參見(jiàn)天根凝膠回收試劑盒，其它實(shí)驗(yàn)步驟參見(jiàn)第三版分子克隆手冊(cè).

1.2.4 Gp64基因的誘導(dǎo)表達(dá)及電透析純化制備野生型E．coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用于重組質(zhì)粒pET28a－Gp64的轉(zhuǎn)化.培養(yǎng)12 h后挑取鑒定正確的目的克隆菌接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，次日按體積比10%轉(zhuǎn)接到100 mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，并向菌液中加入終濃度為0．3 mmol/L的IPTG［11］，在此作對(duì)照試驗(yàn)，其中選擇相同的樣品不加入誘導(dǎo)劑.30℃，200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)5 h后，收集菌液并處理樣品［12］.對(duì)處理后的樣品進(jìn)行SDS－PAGE分析.收集表達(dá)細(xì)菌，6 000r/min離心10 min后稱重.1 g細(xì)菌量用20 mL的緩沖液PBS重懸.混勻后超聲破碎細(xì)胞超聲5 s，間隙5 s，10 min后6 000 r/min室溫離心10 min.再用20 mL的漂洗緩沖液（2 mol/L尿素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．5%曲拉通，1 mmol/L EDTA）重懸后混勻?qū)⒌玫降妮^純凈的Gp64蛋白染色后點(diǎn)樣，大概點(diǎn)樣500μL，將得到的膠塊考馬斯亮藍(lán)染色15 min.脫色過(guò)夜至蛋白膠無(wú)蛋白位置無(wú)色.將目的蛋白所在的區(qū)域用潔凈的小刀切下來(lái)，裝入處理好的透析袋中，加入1 mL Tris－Gly緩沖液，置4℃30 min.取事先放置在4℃的Tris－Gly緩沖液加入到核酸電泳儀，將含有目的蛋白的透析袋放入，電泳2～3 h，每間隔1 h更換預(yù)冷的緩沖液.電泳結(jié)束后，將透析袋放入pH8．0的PBS緩沖液中透析過(guò)夜.透析結(jié)束后，取透析液蛋白電泳分析純化結(jié)果［13］.

1.2.5 抗Gp64蛋白抗體制備及特異性檢測(cè)以Gp64蛋白為抗原，進(jìn)行大白兔免疫實(shí)驗(yàn).汲取1 mL蛋白溶液（400~600 ng/mL）對(duì)大白兔進(jìn)行雙腿靜脈注射.在飼養(yǎng)間隔14 d和28 d后進(jìn)行第1次和第2次加強(qiáng)針注射.繼續(xù)培養(yǎng)11 d后取靜脈血，收集抗體進(jìn)行抗體利用蛋白印記進(jìn)行特異性檢測(cè).其中特異性一抗1∶4 000進(jìn)行稀釋.羊抗兔二抗1∶8 000進(jìn)行稀釋.

2 結(jié)果和分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a－Gp64的構(gòu)建

圖1、2為重組質(zhì)粒pET28a－Gp64的構(gòu)建的電泳圖.

圖1 全長(zhǎng)和截短Gp64DNA序列PCR電泳圖Fig.1 PCR-Electrophoreses about Gp64 and truncate Gp64 DNA sequence

圖2 Gp64和pET28a凝膠回收后電泳圖Fig.2 Electrophoreses after gel extraction about Gp64 and pET28a

PCR后通過(guò)電泳得到截短Gp64DNA圖，結(jié)果顯示與預(yù)期結(jié)果相同，在1 000 bp左右位置有亮帶.所需要的目的DNA經(jīng)過(guò)凝膠電泳純化，通過(guò)DNA電泳可知純化得到的較純凈的DNA，用于做連接反應(yīng)，目的在于增加連接效率.

2.2 重組質(zhì)粒PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)

挑選3個(gè)重組子做菌落PCR檢測(cè)，其結(jié)果如圖3所示，都能擴(kuò)增出很明顯的目的片段.然后，將選擇1、2號(hào)進(jìn)一步進(jìn)行酶切檢測(cè)，分別采用EcoRV和EcoRI雙酶切，EcoRI和EcoRV單酶切.根據(jù)質(zhì)粒圖譜分析重組子采用EcoRI和EcoRV單酶切出現(xiàn)6 300 bp左右條帶；采用EcoRV和EcoRI雙酶切出現(xiàn)1 381 bp和4 914 bp條帶.選擇正確的重組子進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，捕獲所需要的目的重組子.

2.3 目的蛋白的表達(dá)及純化

通過(guò)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，對(duì)樣品進(jìn)行相同處理后，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%SDS－PAGE電泳圖得到如下圖5所示，其中加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)的菌種在29~44 kD之間明顯產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)，與理論上目的蛋白40 kD相符合.所以目的蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá).圖6顯示，經(jīng)過(guò)電透析純化的蛋白純度較高，符合下一步實(shí)驗(yàn)的要求.

2.4 抗體的制備及特異性檢測(cè)

利用制備的抗體進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示，其中檢測(cè)抗原為電透析純化的Gp64蛋白.圖7說(shuō)明制備的抗體具有識(shí)別Gp64蛋白能力，該圖中抗原按照一定的稀釋度點(diǎn)樣，當(dāng)樣品量高時(shí)，得到的條帶不單一表明抗體的純度不高.由于免疫試驗(yàn)所提供的蛋白純度不夠，雜蛋白對(duì)抗體的特異性有一定的影響.可以利用電透析純化的目的蛋白對(duì)所制備的抗體進(jìn)行純化，增加抗體的特異性.

圖3 PCR檢測(cè)重組子電泳圖片F(xiàn)ig.3 PCR electrophoreses about recombination bacterial colony

圖4 酶切檢測(cè)重組子電泳圖片F(xiàn)ig.4 Electrophoreses about recombination DNA

圖5 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Fig.5 Expression about purpose protein

圖6 目的蛋白純化圖片F(xiàn)ig.6 Purification about purpose protein

圖7 蛋白印跡Fig.7 Western Blot

3 討論

Gp64蛋白是核型多角體病毒囊膜上的一個(gè)經(jīng)糖基化修飾的功能蛋白，在病毒入侵宿主細(xì)胞和出芽型病毒轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中都起重要作用［14］.為了進(jìn)一步研究桿狀病毒Gp64蛋白在病毒感染宿主過(guò)程表達(dá)檢測(cè)及尋找其相互作用蛋白，制備高效價(jià)的抗Gp64蛋白抗體是極為重要的一步.我們對(duì)Gp64基因的完整讀碼框進(jìn)行擴(kuò)增，并將構(gòu)建的重組載體導(dǎo)入BL21（DE3）表達(dá)菌，多次對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行摸索，同時(shí)更換表達(dá)菌等嘗試無(wú)法獲得原核表達(dá)的Gp64蛋白（結(jié)果未顯示）.分析原因可能是Gp64蛋白為囊膜蛋白，它的跨膜區(qū)域會(huì)阻止蛋白質(zhì)的折疊，從而影響目的蛋白的合成［10－11］；其次稀有密碼子對(duì)蛋白翻譯的影響，目標(biāo)蛋白跨膜區(qū)域周圍存在較多的稀有密碼子，在翻譯時(shí)出現(xiàn)了翻譯障礙導(dǎo)致蛋白合成終止而無(wú)法正常合成目的蛋白［9］.通過(guò)分析，切除其跨膜區(qū)域后，將重新構(gòu)建的重組子導(dǎo)入到BL21表達(dá)菌中實(shí)現(xiàn)了Gp64截短蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá).對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行電透析純化.其中使用6×His標(biāo)簽進(jìn)行純化，但是表達(dá)的蛋白為包涵體蛋白，在洗滌變性過(guò)程中，高鹽濃度對(duì)于鎳柱吸附效率影響很大，純化量及純度遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求（結(jié)果未顯示），故采用電透析純化.利用該蛋白進(jìn)行大白兔免疫實(shí)驗(yàn)得到了特異性結(jié)合Gp64蛋白的抗體，為Gp64蛋白后續(xù)的表達(dá)檢測(cè)及研究其相互作用的蛋白奠定了基礎(chǔ).

致謝

感謝湖北省科技廳的資助！

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Prokaryotic expression of Autographa californica multiple nucleopolyhedro virus Gp64 gene

ZHANG You－h(huán)ong1，2，XIONG Yao1，2，ZHOU Feng1，2，XU Zhi－peng1，2，CHEN Jie1，2，CHEN Xing－zhou1，2
1.School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.Key Laboratory for Green Chemical Process（Wuhan Institute of Technology），Ministry of Education，Wuhan 430074，China

Gp64 protein is one of important function proteins in baculovirus virion during infectious process．Specific primers were designed by Oligo6．0 to amplify and purify a truncated fragment of silk wormautographa californicamultiple nucleopolyhedro virus Gp64 gene with polymerase chain reaction The purified target DNA fragment was subjected to double enzymatic digestion withEcoRⅠandXhoⅠwhile prokaryotic expression vector pET28a was cut byEcoRI andSalI，then the ligation between the two products was carried out；E．coliBL21（DE3）cells that had caught the recombinant plasmid pET28a－GpP64 were induced with isopropyl－β－D－thiogalactoside，the induced product was then analyzed with SDS－PAGE．And the results show that the amplified target is expressed.The protein was purified by electro dialysis，which makes for the preparation of anti Gp64 antibody．

AcMNPV；Gp64 protein；Gp64 gene；expression；purification

Q71

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.07.003

1674－2869（2015）07－0011－05

本文編輯：張瑞

2015－03－30

湖北省自然科學(xué)重點(diǎn)基金（2013CFA101）

作者介紹：張佑紅（1964－），男，湖南瀏陽(yáng)人，教授，博士研究生導(dǎo)師．研究方向：基因工程.