7個綿羊和7山羊品種DLX3基因3′非編碼區(qū)803A＞G突變的檢測

古麗格娜，艾買提·買買提，於建國，楊會國，郝 耿，儲明星，買買提明，潘章源，狄 冉，劉秋月

（1.新疆畜牧科學院畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京 100193；3.新疆畜牧廳南山種羊場，新疆 烏魯木齊 830001）

7個綿羊和7山羊品種DLX3基因3′非編碼區(qū)803A＞G突變的檢測

古麗格娜1，艾買提·買買提1，於建國1，楊會國1，郝 耿1，儲明星2*，買買提明3，潘章源2，狄 冉2，劉秋月2

（1.新疆畜牧科學院畜牧研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京 100193；3.新疆畜牧廳南山種羊場，新疆 烏魯木齊 830001）

DLX3基因3′非編碼區(qū)803A>G突變與法國Lacaune綿羊高繁殖力密切相關座位FecL高度連鎖。本研究采用PCR-SSCP方法在具有不同繁殖力的7個綿羊品種（湖羊、小尾寒羊、洼地綿羊、杜泊、陶賽特、特克塞爾、德國美利奴羊）和7個山羊品種（濟寧青山羊、貴州白山羊、金堂黑山羊、成都麻羊、遼寧絨山羊、波爾山羊、安哥拉山羊）中檢測DLX3基因803A>G突變，探究該突變與綿羊和山羊高繁殖力的關聯(lián)性。結(jié)果表明這14個綿羊和山羊品種都不存在c.*803A>G突變，提示DLX3基因的c.*803A>G突變對這14個綿羊和山羊的繁殖力沒有顯著影響。

綿羊；山羊；繁殖力；DLX3基因；PCR-SSCP

同源盒基因（distal-less homeobox gene，DLX3）是同源異型框轉(zhuǎn)錄因子DLX家族中的一員，DLX3基因在哺乳動物的上皮組織、骨組織及胎盤發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。DLX3被定位于人17號染色體q21-22區(qū)域，它是Wnt信號通路的下游基因，能通過調(diào)控EGFR、蛋白激酶等信號通路影響絨毛滋養(yǎng)層細胞等細胞類型的生長分化（Chui等，2013）。

Bodin等（2002）對Lacaune綿羊后代的排卵數(shù)進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)其平均每次排卵6.5枚，其中超過6枚的個體占統(tǒng)計總數(shù)的38.4%，研究認為在Lacaune綿羊中存在影響其排卵數(shù)的主效基因。Bodin等（2003）將該基因命名為FecL基因，該基因被定位在綿羊第11號染色體的一個2.6cM區(qū)間內(nèi)。Drouilhet等（2009）對綿羊高繁殖力主效基因FecL進行了精細定位，發(fā)現(xiàn)FecL位于BM17132和DLX3這兩個分子標記之間，在此區(qū)間內(nèi)，F(xiàn)ecLL突變與其中一種特殊單倍型緊密連鎖，此單倍型可根據(jù)DLX3基因3′UTR內(nèi)的一個SNP（c.*803A>G）進行預測，該SNP能對攜帶和非攜帶FecLL突變的綿羊進行分類，準確率高達99.5%，因此這個突變位點可作為綿羊多羔性狀的一個分子標記。

目前國內(nèi)還未見分析綿羊和山羊DLX3基因3′UTR的特殊SNP位點與羊高繁殖力相關聯(lián)方面的報道。本文以繁殖力存在差異（耿彩霞等，2011；王金鑫等，2013）的14個綿羊和山羊品種為實驗材料，采用PCR-SSCP方法檢測DLX3基因3′非編碼區(qū)c.*803A>G突變在7個不同綿羊和7個不同山羊品種中的分布情況，試圖尋找與綿、山羊繁殖力相關的遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取7個綿羊品種（湖羊、小尾寒羊、洼地綿羊、杜泊、陶賽特、特克塞爾、德國美利奴羊）和7個山羊品種（濟寧青山羊、貴州白山羊、金堂黑山羊、成都麻羊、遼寧絨山羊、波爾山羊、安哥拉山羊），每個品種隨機抽取選擇20只生產(chǎn)母羊，采集頸靜脈血樣10 mL/只，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃凍存。用酚-氯仿法提取全基因組DNA，TE緩沖液-20℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

根據(jù)GenBank公布的綿羊DLX3基因全長序列（FJ654646），利用Premier Primer 5.0和Oligo 7軟件，在3′非編碼區(qū)設計一對引物。引物序列：上游引物5′-CCCATGTACAGGACTTTGCAC-3′；下游引物5′-AGCTTACTGGAGGAGAGGAAG-3′。

1.2.2 PCR擴增

反應體系為20 μL，其中：Taq MIX 10 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板（50 ng/μL）2.5 μL，去離子水6.5 μL。擴增條件：95℃5 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃20 s，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.3 SSCP分析

取PCR產(chǎn)物2 μL與變性劑7 μL混勻，98℃變性10 min，冰浴7 min。將變性后的PCR產(chǎn)物在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中常溫電泳后進行銀染，最后用凝膠成像儀拍照和分析。

1.2.4 測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，用膠回收試劑盒（BBI，Canada）回收目標片段，純化后交由北京華大生物技術有限公司用ABI PRISM 377 DNA自動測序儀進行序列測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊DLX3基因的PCR擴增

DLX3基因片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示擴增條帶與預計片段大小 （167 bp）相符（圖1），可直接進行SSCP分析。

圖1 綿羊和山羊DLX3基因的PCR擴增

2.2 擴增片段SSCP分析

對14個綿羊和山羊品種DLX3基因的擴增片段分別進行SSCP分析，發(fā)現(xiàn)所擴增片段均不存在多態(tài)性，以湖羊為例，聚丙烯酰胺凝膠結(jié)果見圖2。

圖2 DLX3基因擴增片段的SSCP分析（湖羊）

2.3 綿羊和山羊DLX3基因擴增序列比對分析

僅對小尾寒羊和濟寧青山羊擴增區(qū)域進行了測序，獲得序列片段大小均為167 bp；對測序序列進行比對分析后發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊和濟寧青山羊擴增區(qū)域均沒有c.*803A>G多態(tài)突變。

圖3 DLX3基因3′非編碼區(qū)c.＊803處位點堿基

3 討論

試驗所選擇的7個綿羊品種和7個山羊品種中，主要涵蓋了國內(nèi)外較高產(chǎn)羔率的綿羊品種：湖羊、小尾寒羊、洼地綿羊，較低產(chǎn)羔率的綿羊品種：杜泊、陶賽特、特克塞爾、德國美利奴羊；以及較高產(chǎn)羔率的山羊品種：濟寧青山羊、貴州白山羊、金堂黑山羊，較低產(chǎn)羔率的山羊品種：遼寧絨山羊、安哥拉山羊、成都麻羊、波爾山羊。關于這些在繁殖力性狀上存在差異的綿、山羊品種，已廣泛地被研究者視為探究羊繁殖力分子機制的重要材料；目前，BMPR1B、BMP15和GDF9等基因的遺傳多態(tài)性已多次在綿、山羊品種中被探索，且均未達到區(qū)分各品種羊繁殖力水平差異的研究目的。

FecL是Bodin等研究者在法國Lacaune綿羊群體中發(fā)現(xiàn)的多羔主效基因座位，F(xiàn)ecL是遺傳方式已知的多羔主效基因Lacaune的突變體（Bodin等，1998），F(xiàn)ecL提高排卵數(shù)的效應與BMPR-IB相似，具有加性效應，雜合子增加排卵數(shù)1.0枚，純合子增加排卵數(shù)2.0枚。Lecerf等（2002）通過基因掃描將Lacaune定位在綿羊11號常染色體上。Drouilhet等（2009）利用全基因組掃描對FecL進行精細定位，將區(qū)間縮小到BM17132和FAM117A兩個標記之間，通過與人的同源區(qū)域比對，發(fā)現(xiàn)在這兩個標記之間的20個同源基因沒有任何一個屬于BMP信號通路系統(tǒng)，而目前已發(fā)現(xiàn)確認的所有多羔基因都屬于BMP家族，因此對FecLL突變進行基因定位有助于發(fā)現(xiàn)調(diào)控排卵數(shù)的新通路。Drouilhet等（2009）并沒有將FecLL定位到特定基因，但他們卻發(fā)現(xiàn)了一個非常有用的SNP，通過這個SNP可以將Lacaune綿羊分成L/L、L/+及+/+三種基因型。在精細定位獲得的區(qū)間內(nèi)，F(xiàn)ecLL突變與其中一種特殊單倍型緊密連鎖，此單倍型可以根據(jù)位于此區(qū)間邊緣的DLX3基因的3’UTR內(nèi)的一個SNP（c.*803A>G，終止密碼子后第803個堿基）進行預測。它與FecLL突變高度連鎖不平衡，這個突變以99.5%的準確性能夠預測動物是否攜帶FecLL高產(chǎn)基因。同時研究者還發(fā)現(xiàn)在175只未攜帶FecLL突變的綿羊中有106只綿羊DLX3基因3′非編碼區(qū)803 bp處為AA基因型，65只為AG基因型，4只為GG基因型，三種基因型產(chǎn)羔數(shù)的估計育種值分別為+1.25± 11.5、+19±11.7和+32.3±5.25。這一結(jié)果表明DLX3基因3′非編碼區(qū)803G等位基因與高產(chǎn)羔數(shù)高度相關。Drouilhet等（2013）通過高通量測序技術，將FecLL進一步定位在胰島素樣生長因子ⅡmRNA結(jié)合蛋白(IGF2BP1)和β1,4-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2(B4GALNT2)兩個基因上，通過后續(xù)驗證表明FecLL位于B4GALNT2基因上，B4GALNT2基因?qū)е侣殉蔡禺惖鞍滋腔钦{(diào)控綿羊排卵數(shù)的全新機制。而先前的結(jié)果表明FecL基因的突變以不同方式影響卵巢功能，與+/+型母羊相比，L/L型母羊顆粒細胞中FSHR和STAR mRNA水平較高，卵泡期有LH峰值出現(xiàn)，雌激素顯著增加，黃體期孕酮的水平較高，而外周循環(huán)中FSH濃度在兩基因型間差異不顯著，垂體中L/L型母羊ESR2 mRNA的表達量顯著低于+/+母羊（Drouilhet等，2010）。

本研究在小尾寒羊、濟寧青山羊等14個綿羊和山羊品種中都未檢測到DLX3基因3′非編碼區(qū)c. *803A>G突變。究其原因，一方面可能此突變在綿羊和山羊品種中的頻率較低，本研究分析的樣本數(shù)過少導致未能檢出該突變；另一方面，該突變可能不是影響本研究所選綿、山羊的繁殖力差異主要因素。本研究只是對DLX3部分序列多態(tài)性進行了初步分析，下一步還需要擴大樣本數(shù)或?qū)LX3全基因序列開展多態(tài)篩查。

[1]耿彩霞，馮濤，儲明星，等.綿羊GDF9基因FecTT突變檢測[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報,2011,38(3):341～345.

[2]王金鑫，馮濤，儲明星，等.山羊生長分化因子9基因FecTT突變檢測[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(3): 123～126.

[3]Bodin L,Elsen J M,Poivey J P,et al.Hyper-prolificacy in the French Lacaune sheep breed:a possible major gene[C].In:Proceedings of the 6th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Armidale,Australia.1998,（27）:11～14.

[4]Bodin L,San Cristobal M,Lecerf F,et al.Segregation of a major gene influencing ovulation in progeny of Lacaune meat sheep[J].Genet Sel Evol,2002,34(4):447～464.

[5]Bodin L,Lecerf F,Pisselet C,et al.How many mutations are associated with increased ovulation rate and litter size in progeny of Lacaune meat sheep?[C].In:Proceedings of the International Workshop on Major Genes and QTL in Sheep and Goat,Toulouse,INRA,France.2003:2～11.

[6]Chui A,Kalionis B,Abumaree M,et al.Downstream targets of the homeobox gene DLX3 are differentially expressed in the placentae of pregnancies affected by human idiopathic fetal growth restriction[J].Mol Cell Endocrinol,2013,377(1-2):75～83.

[7]Drouilhet L,Lecerf F,Bodin L,et al.Fine mapping of the FecL locus influencing prolificacy in Lacaune sheep[J].Anim Genet,2009,40(6):804～812.

[8]Drouilhet L,Mansanet C,Sarry J,et al.The highly prolific phenotype of Lacaune sheep is associated with an ectopic expression of the B4GALNT2 gene within the ovary[J].PLoS Genetics,2013,9(9):e1003809.

[9]Drouilhet L,Taragnat C,Fontaine J,et al.Endocrine characterization of the reproductive axis in highly prolific Lacaune sheep homozygous for the FecLL mutation[J].Biol Reprod,2010,82(5):815～824.

[10]Lecerf F,Mulsant P,Elsen JM,et al.Localisation and mapping of a major gene controlling ovulation rate in Lacaune sheep[C].In:Procee dings of the 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production.Montpellier:INRA,Castanet-Tolosan,France.2002,（30）:753～756.

Detection on 803A＞G Mutation in 3′Untranslated Region of DLX3 Gene in Sheep and Goats

Guligena1,AIMAITI·Maiti1，YU Jian-guo1，YANG Hui-guo1,HAO Geng1,CHU Ming-xing2*,Maimaitiming3, PAN Zhang-yuan2,DI Ran2,LIU Qiu-yue2
(1.Institute of Animal Science,Xinjiang Academy of Animal Sciences,Urumqi 830000,China；2.Key Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China; 3.Nanshan Sheep Breeding Farm of Livestock Bureau of Xinjiang,Urumqi 830001,China)

Previous studies had shown that there was a strong linkage disequilibrium between DLX3 gene 3' noncoding region 803A>G mutation and FecL which was closely related with high fecundity of French Lacaune sheep.The 803A>G mutation of DLX3 gene was detected in seven sheep breeds (Small Tail Han, Hu,Wadi,Dorset,Texel,Dorper,Germany Mutton Merino sheep)and seven goat breeds(Jining Grey,Guizhou White,Jintang Black,Chengdu Ma,Liaoning Cashmere，Boer,Angora goats)using PCR-SSCP.The results indicated that the 803A>G mutation did not exist in the fourteen breeds tested.The 3′untranslated region of DLX3 gene was highly conserved among sheep and goats.The 803A>G mutation had no significant effect on prolificacy in the above fourteen breeds.

sheep；goat；prolificacy；DLX3 gene；PCR-SSCP

S818.9

：A

：1003－6377（2015）04－0015-05

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目(2013911056)、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS13）和國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術體系專項(CARS-39)資助

古麗格娜(1970-)，女，副研究員，長期從事動物遺傳育種與繁殖工作。E-mail:1289112072@qq.com

儲明星（1968-），男，博士，研究員，博士生導師。從事動物遺傳育種與繁殖工作。E-mail:mxchu@263.net

2015-04-16，

2015-05-03