血凝抑制試驗檢測犬血清中乙腦抗體

賈杏林，黎攝兒，謝軍芳，?？〕?，李曉云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

血凝抑制試驗檢測犬血清中乙腦抗體

賈杏林，黎攝兒，謝軍芳，?？〕?，李曉云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

為調(diào)查犬血清中流行性乙型腦炎抗體存在情況，以高嶺土和鴿紅細(xì)胞消除犬血清中非特異性凝集因素干擾,采用血凝抑制試驗檢測了血清中乙腦抗體。檢測的34份犬血清樣本中流行性乙型腦炎血凝抑制抗體陽性21份,陽性率61.8%,以1∶20～1∶80的抗體為主(95.2%)。結(jié)果表明，在犬血清中檢出了流行性乙型腦炎抗體,且陽性率較高,提示犬體內(nèi)存在乙腦病毒感染的可能。

犬；血凝抑制試驗；流行性乙型腦炎；抗體

乙型腦炎(JE)是一種人畜共患傳染病，引起人的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和豬的繁殖障礙性疾病[1]。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,近年來寵物作為伴侶動物日益成為人們生活的一部分。小動物臨床診療中發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)癥狀患犬經(jīng)犬瘟熱檢查結(jié)果為陰性,以及一些公犬睪丸腫大，具有乙腦的癥狀，因而寵物是否攜帶乙腦病毒、是否發(fā)生乙腦疾病成為一個需要研究的課題，但目前該方面研究報道較少。為此，本研究采用傳統(tǒng)的血凝抑制試驗檢測了34份犬的血清抗體，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試劑為某寵物醫(yī)院就診的寵物犬血清34份；乙腦血凝抑制試驗診斷試劑購自云南流行病學(xué)防治研究所；乙腦陽性血清采用乙腦弱毒疫苗免疫犬3次制備(HI效價為1∶40)；乙腦陰性血清采自臨床健康犬(HI結(jié)果為陰性)；生理鹽水、pH7.4PBS，pH9.0硼酸鹽緩沖液、pH6.4磷酸鹽緩沖液、12.5%高嶺土懸液采用常規(guī)配制；40%的鴿紅細(xì)胞懸液和0.5%鴿紅細(xì)胞懸液用pH6.4磷酸鹽緩沖液配制。

1.2試驗方法

(1)血凝試驗 首先用pH9.0硼酸鹽緩沖液2 mL充分溶解乙腦血凝素抗原，混勻，4 ℃過夜，3 000 r/min離心20 min,取上清液作為血凝素抗原；加入pH9.0硼酸鹽緩沖液于清潔干燥96孔V型微量板中，每孔25 μL。再加入25 μL乙腦血凝素于第一孔中，倍比稀釋，使血凝素充分混勻，最后1孔混勻后棄掉25 μL。最后每孔中加入25 μL 0.5%的鵝紅細(xì)胞溶液,充分混合,室溫1 h后判斷結(jié)果。

結(jié)果判定：++++為一層粉紅色的紅細(xì)胞均勻分散于孔底；+++基本同上，但邊緣不整齊有下垂趨勢；++為紅細(xì)胞于孔底形成環(huán)狀，環(huán)中央內(nèi)徑3 mm以上；+為紅細(xì)胞于孔底形成一個圈，但邊緣不光滑，四周有小凝集塊；-為紅細(xì)胞于孔底形成圓點。以50%紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集(++)時，血凝素的最高稀釋度為4個單位的血凝素單位。

(2)血清處理 首先取0.1 mL血清加12.5%高嶺土溶液0.9 mL，混合后放室溫中20 min，然后2 500 r/min離心15 min，加入40%鴿紅血細(xì)胞懸液(用pH6.4磷酸鹽緩沖液配制)0.1 mL,振蕩混勻，在37 ℃吸附1 h，然后1 500 r/min離心10 min，直至其不凝集0.5%鴿紅細(xì)胞，上清液即為HI試驗血清(1∶10)。

(3)血凝抑制試驗 乙腦血凝抑制試驗按文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行：用12.5%高嶺土溶液及40%鴿紅細(xì)胞溶液吸附待檢血清，直至完全不凝集0.5%鴿紅細(xì)胞，HI試驗采用4個單位的血凝素。加入pH9.0硼酸鹽緩沖液于清潔干燥96孔V型微量板中，每孔25 μL。再加入1∶10血清25 μL 于清潔干燥96孔V型微量板中于第一孔，倍比稀釋，充分混勻，最后一孔棄掉25 μL。再于每孔中加入25 μL血凝素，充分混勻，加蓋置室溫1 h。最后于每孔中加入0.5%的鴿紅細(xì)胞懸液50 μL,充分混合,室溫1 h后判斷結(jié)果。結(jié)果判定：HI效價大于1∶20判為陽性。實驗孔全部呈現(xiàn)+++和++++的紅細(xì)胞凝集為陰性結(jié)果，陽性結(jié)果以++凝集孔作為該份血清的終點抑制效價。

2 結(jié)果與分析

表1 34份犬血清中乙腦抗體檢測結(jié)果

從表1可知,34份被檢血清中，陽性血清21份，占總數(shù)61.8%；20份血清血凝抑制效價在1∶20～1∶80之間，占陽性血清的95.2%。

3 討論

犬是人類伴侶動物,隨著我國城市化進(jìn)程加快和社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，其數(shù)量不斷增加，與人類關(guān)系愈來愈密切，其是否感染乙腦是一個值得研究的課題,目前尚未見到研究報道。本研究在犬血清中檢出了流行性乙型腦炎抗體,且陽性率較高,提示存在犬感染乙腦病毒的可能性,因此,有必要作進(jìn)一步研究和探索。

乙腦是以腦實質(zhì)炎癥、神經(jīng)原變性、壞死為主要病理特征的中樞神系統(tǒng)疾病，從大腦到脊髓都可被侵犯[3]。在檢測的臨床樣本中，8只病犬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，但犬瘟檢測為陰性，乙腦檢測為陽性，經(jīng)問診犬只未進(jìn)行過乙腦疫苗注射,因而可能為乙腦病毒侵害了犬的神經(jīng)系統(tǒng)而引起了神經(jīng)癥狀。

乙腦血凝抑制試驗可以很好地用來檢測乙腦炎病毒野毒感染產(chǎn)生的血凝素抗體效價，具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點，因而本試驗采用了該方法。但犬血清非特異性凝集較多，在試驗中發(fā)現(xiàn)用30%鴿紅細(xì)胞懸液處理犬血清后仍有一部分犬血清中非特異性凝集未消除，便將濃度提高到40%[3]，消除了大部分被檢犬血清與0.5%的鴿紅細(xì)胞懸液的凝集情況，還有一些犬血清非特異性凝集仍未消除，采用鴿紅細(xì)胞泥進(jìn)行吸附，這樣既沒有改變待檢血清的體積，又消除了血清中非特異性凝集。

[1]殷 震，劉景華.動物病毒學(xué)(第2版)[M].北京:科學(xué)出版社，1997.633～641.

[2]自登云,陳伯權(quán),俞永新.蟲媒病毒與蟲媒病毒病[M].昆明：云南科技出版社,1994.151～155.

[3]Jia Xinglin,Chen Huanchun,Wang Xiang,etal.Quantitative and qualitative study of Enzyme-linked Immunosorbent Assay to detect IgG against Japanese Encephalitis Virus in swine sera[J].Veterinary Research Communications,2005,29:159～169.

10.3969/j.issn.1673-1409.2011.01.083

S851.34+7.1

A

1673-1409(2011)01-0231-02

2010-12-09

湖南省教育廳資助項目(07C356)

賈杏林(1970-)，男，湖北天門人，博士，副教授，研究方向為動物輸血與血液病.

李曉云，E-mail：lxy86806@yahoo.com.cn.