不同刺槐種源根瘤菌16S rDNA的PCR-RFLP分析1)

張澤坤 韓 騫 楊敏生 王進茂

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定，071000)

根瘤菌是一類存在于土壤中的能侵染豆科植物的根部共生形成根瘤，并將空氣中的氮還原成氨供植物營養(yǎng)的一類革蘭氏陰性菌。根瘤菌遺傳多樣性一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點。然而，多年來豆科植物根瘤菌資源多樣性的研究多偏重于與農(nóng)牧業(yè)關(guān)系密切的豆科作物和牧草方面，對豆科樹種根瘤菌的研究較少。在研究豆科植物和根瘤菌共生固氮關(guān)系的文獻中，刺槐根瘤菌共生體被作為研究對象的的報道不常見。特別是關(guān)于不同地理環(huán)境下不同種源刺槐根瘤菌的遺傳多樣性研究還未見報道。根瘤菌與豆科植物的共生固氮作用受宿主的基因型、根瘤菌的競爭結(jié)瘤能力及環(huán)境因素的影響［1-2］。區(qū)域地理環(huán)境對根瘤菌與宿主共生關(guān)系的影響很大，有的豆科植物在不同的地理區(qū)域中會與不同種的根瘤菌結(jié)瘤固氮［3］。本研究采用16S rDNA PCR-RFLP分子標記技術(shù)，對分離自2種地理環(huán)境中的19個不同刺槐種源的38株根瘤菌和6株參比菌株進行了遺傳多樣性分析，并通過代表菌株測序確定其系統(tǒng)發(fā)育地位，討論不同地理環(huán)境下不同種源刺槐與共生根瘤菌遺傳多樣性差異，為合理開發(fā)利用根瘤菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以河北農(nóng)業(yè)大學(xué)保定教學(xué)基地(土壤類型為壤土，BD)和石家莊高邑林場(土壤類型為黏土，GY)栽植的2片刺槐(Robinia pseudoacacia)種源試驗林為對象，19個種源種子的產(chǎn)地見表1。2005年3月份將19個種源的1年生苗木在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)保定教學(xué)基地和河北高邑林場建立種源試驗林。采用隨機完全區(qū)組設(shè)計，4次重復(fù)，10株小區(qū)，試驗林采用穴植，株行距1 m×2 m，試驗地周圍設(shè)保護行。2008年從每一片試驗林中分別采集19個刺槐種源樣本的根瘤。采用Vincent經(jīng)典方法［4］進行分離、純化，并鏡檢驗證，待測菌株編號按順序從BD-1至BD-19、GY-1至GY-19。6株參比菌株購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心，分別為USDA6T(慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum))、USDA1002T(苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))、USDA205T(費氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii))、USDA2370T(豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum))、ACCC19665T(紫穗槐根瘤菌(Mesorhizobiumamorphae))、NZP2213T(百脈根根瘤菌(Mesorhizobium loti))。

表1 19個刺槐種源產(chǎn)地氣象因子

1.2 菌體培養(yǎng)及總DNA提取

菌株經(jīng)YMA斜面活化后，接種于TY培養(yǎng)液(胰蛋白胨 5.0 g/L，酵母粉 3.0 g/L，CaCl21.3 g/L，pH6.8～7.0)中振蕩培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)至對數(shù)中后期，收集菌體。DNA提取方法參照文獻［5］。YMA培養(yǎng)基的配方為甘露醇 10.0 g/L，酵母粉 1.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2 g/L。Rh微量元素液主要成分為H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L，pH6.8 ～7.0。

1.3 16S rDNA的PCR擴增

PCR擴增所用引物來源于E.coli 16S rDNA基因序列保守區(qū)域，正向引物P1(5'-AgA gTT TgA TCM Tgg CTC Ag-3')，反向引物 P6(5'-AAg gAg gTg WTC CAR CC-3')。

PCR 擴增反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L P1 和 P6 各 1 μL，DNA 模板 1 μL，5 U/μL DNA 聚合酶 0.5 μL，補足ddH2O 至 50 μL。

PCR擴增條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，53 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 40 s，30 個循環(huán)后于72℃保溫7 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小(約1.5 kb)。

1.4 16S rDNA PCR-RFLP 分析

根據(jù)文獻［6］選取4種限制性內(nèi)切酶(Hae III、Hinf I、Msp I、Rsa I)，酶切反應(yīng)體系均為20 μL，37 ℃酶切過夜。全部酶切產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混勻后點樣，2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖譜用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5 16S rDNA全序列測定分析

根據(jù)16S rDNA PCR-RFLP聚類分析結(jié)果，選取代表菌株GY-2的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。將所測序列在GenBank中進行比對，確定與其他根瘤菌的序列相似性，并與部分根瘤菌已知種的全序列進行比較，利用MEGA4軟件，采用鄰接法，構(gòu)建以16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。并用DNAMAN計算代表菌株與各參比菌株16S rDNA序列相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA PCR-RFLP 酶切結(jié)果

用引物P1和P6對供試菌株的16S rDNA進行PCR擴增后，結(jié)果檢測均得到一條1 500 bp左右的擴增條帶，擴增產(chǎn)物分別用4種限制性內(nèi)切酶(Hae III、Hinf I、Msp I、Rsa I)酶切后，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)保定教學(xué)基地的19個供試菌株分別得到6、7、5、5種酶切圖譜類型，獲得12種遺傳圖譜類型;石家莊高邑林場的19個供試菌株分別得到7、9、8、8種酶切圖譜類型，獲得14種遺傳圖譜類型，38個供試菌株共獲得26種遺傳圖譜類型(表2)。從表2可看出，保定地區(qū)不同種源間刺槐根瘤菌的酶切圖譜類型有的是完全一致的，例如BD-2和BD-4的酶切圖譜類型屬于類型2(baba)，BD-3、BD-7和BD-8屬于類型3(bbcb);高邑地區(qū)有的也是一致的，例如GY-3、GY-5、GY-6和GY-9屬于類型15(ckhh)，而地區(qū)間的根瘤菌酶切圖譜類型沒有完全一致的，說明地區(qū)間根瘤菌遺傳多樣性豐富。部分菌株酶切圖譜見圖1。

2.2 16S rDNA PCR-RFLP 聚類結(jié)果

將菌株的16S rDNA酶切圖譜類型轉(zhuǎn)化為計算機可以識別的數(shù)值“0”和“1”，通過PopGen32軟件計算各菌株間的遺傳距離和遺傳相似性，利用DPS軟件的UPGMA法進行聚類分析，得出以遺傳距離為依據(jù)的菌株16S rDNA PCR-RFLP聚類分析樹狀圖(圖2)。供試菌株16S rDNA的遺傳距離呈現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。在遺傳距離為0.4上，菌株分為4大類:第1類跟已知參比菌株聚在一起;第2類BD-3、BD-7、BD-8、BD-17 聚在一起;第3 類最大，由28株根瘤菌組成;第4類跟其他3類遺傳聚類較遠，屬于未知的系統(tǒng)發(fā)育分支。第3類在遺傳距離為0.25處，又可以分為3個亞類，可以看出大部分同一地區(qū)的根瘤菌聚在了一起，地區(qū)間根瘤菌的遺傳多樣性要比不同種源間根瘤菌遺傳多樣性豐富。

表2 供試菌株的16S rDNA PCR-RFLP電泳圖譜分析

圖1 部分菌株16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物酶切圖譜

2.3 16S rDNA PCR-RFLP 相關(guān)分析

用SPSS17.0軟件檢測同一地區(qū)不同種源間刺槐根瘤菌的遺傳距離與地理距離和氣象因子的相關(guān)性。結(jié)果(表3)顯示，保定地區(qū)的菌株遺傳距離與種源間的經(jīng)緯度和年均降水量都有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為 0.171、0.243、0.226，且都達到極顯著相關(guān)關(guān)系。相反，高邑地區(qū)的菌株遺傳距離與種源間的經(jīng)緯度、年均溫和年均降水量相關(guān)性都不明顯。從表3中可以看出，保定地區(qū)菌株遺傳距離和高邑地區(qū)菌株遺傳距離有顯著負相關(guān)關(guān)系。

表3 菌株遺傳距離與種源地理因子相關(guān)性分析

2.4 16S rDNA全序列分析

根據(jù)菌株16S rDNA的PCR-RFLP聚類分析結(jié)果，測定了代表菌株GY-2的16S rDNA全序列，全長1 424 bp，其GenBank序列登錄號為CL6539，利用MEGA4軟件對GY-2和參比菌株的16S rDNA基因序列進行Neighbor-joining分析，構(gòu)建了反應(yīng)供試菌株與參比菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的發(fā)育樹(圖3)。在系統(tǒng)發(fā)育樹中根瘤菌及土壤桿菌按屬分成Sinorhizobium、Rhizobium、Agrobacterium、Mesorhizobium、Azorhizobium和Bradyrhizobium 6個分支。代表菌株GY-2在系統(tǒng)發(fā)育分類地位上屬于中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)，與中華根瘤菌屬內(nèi)各已知參比菌株16S rDNA序列相似性最小，為96.7%，均大于劃分屬的標準［7］。且與 S.morelense LMG20571的親緣關(guān)系最近，序列相似性達到99.6%。

圖2 16S rDNA PCR-RFLP聚類分析樹狀圖

圖3 16S rDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

采用16S rDNA PCR-RFLP分析方法對不同地理環(huán)境下不同刺槐種源根瘤菌進行了研究，為揭示刺槐根瘤菌的遺傳多樣性以確定其分類地位奠定了基礎(chǔ)，同時也印證了16S rDNA PCR-RFLP是對大量根瘤菌菌株進行初步分類的有效方法。1992年，Batzli等［8］對分離自刺槐的根瘤菌進行了生理生化測定，在60%的相似性水平上分成4個群，籠統(tǒng)的歸屬于Rhizobium。Andreas Ulrich等［9］對生長在德國的刺槐根瘤菌進行表型和16S rDNA分析后，認為76%的菌株在16S rDNA基因型上歸屬于Mesorhizobium，24%的菌株歸屬于 Rhizobium。韋革宏等［10］對楊凌地區(qū)刺槐根瘤菌進行表型多樣性分析后，發(fā)現(xiàn)菌株多樣性豐富，有些菌株屬于 Mesorhizobium。本試驗對38株分離自不同種源刺槐的根瘤菌進行了16S rDNA PCR-RFLP分析，共獲得26種遺傳圖譜類型;UPGMA法聚類分析顯示，菌株在60%相似水平上，分為4大類，各分支內(nèi)菌株間相似性各不相同;而且大部分菌株按地點聚開，地點間菌株遺傳差異大于種源間菌株遺傳差異。其中代表菌株GY-2屬于中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)，與S.morelense LMG20571的親緣關(guān)系最近，序列相似性達到99.6%。以上結(jié)果表明，刺槐根瘤菌存在豐富的遺傳多樣性，且受地理環(huán)境影響較大。

遺傳關(guān)系聚類圖還顯示，本試驗結(jié)果并沒有以刺槐種源地理分布聚類的傾向，只有第3類第2亞類只包括河北和天津種源的菌株，與寄主種源地有直接關(guān)系，而其他分類種源較混雜，表明根瘤菌遺傳差異跟寄主種源的地理分布沒有明顯相關(guān)關(guān)系，菌株多樣性受寄主種源地影響較小。

表3相關(guān)分析的結(jié)果表明，保定地區(qū)菌株跟種源地的地理因子呈正相關(guān)關(guān)系，且有極顯著差異;而高邑地區(qū)菌株跟種源地的地理因子則不相關(guān)，2個地區(qū)間菌株遺傳距離有顯著的負相關(guān)關(guān)系。表明了根瘤菌與寄主植物及地理環(huán)境三者之間的復(fù)雜關(guān)系。

宿主植物和地理環(huán)境是影響根瘤菌分布和多態(tài)性的2個重要因素，生活在特定的生態(tài)環(huán)境中的菌株具有特定的表型和遺傳學(xué)特性。例如新疆中華根瘤菌(Sinorhizobium xinjiangense)［11］和遼寧慢生根瘤菌 (Bradyrhizobium liaoningense)［12］。 本 研 究 中，RFLP分析顯示菌株的地理來源影響其多樣性，呈現(xiàn)出明顯的地理特性。菌株多樣性受不同種源刺槐影響較小。這也證實了環(huán)境條件對根瘤菌多樣性的影響大于寄主專一性的影響。地理環(huán)境對根瘤菌影響主要來自土壤的理化性質(zhì)和溫度，其中最重要的因素是pH值。土壤pH值對根瘤菌的影響早在2001年就有過報道［13］。保定和高邑的土壤類型不一樣，pH值也不同，土壤含水量不同，使得它們的根瘤菌菌群也呈現(xiàn)出顯著差異。

王衛(wèi)衛(wèi)等［14］在研究西北干旱地區(qū)豆科植物根瘤菌時發(fā)現(xiàn)，豆科植物在水分充足地帶如河灘、田埂、樹林等處容易結(jié)瘤且長勢較好，而荒灘、沙地等缺水處結(jié)瘤較少而且形狀小。在采集根瘤時發(fā)現(xiàn)保定壤土上的刺槐根瘤比高邑黏土上的刺槐根瘤長勢好。壤土相對于黏土土壤質(zhì)地較疏松，透氣性好，保水性差，這跟王衛(wèi)衛(wèi)等［14］的報道相反。分析原因為刺槐適宜在土壤疏松的壤土、沙土上生長，在黏土上生長不良，寄主的生長環(huán)境影響與其共生的根瘤菌的生長環(huán)境。刺槐與根瘤菌相互依賴、相互促進生長，體現(xiàn)了寄主與共生體系的復(fù)雜性。

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