Lenzites gibbosa錳過氧化物酶1基因啟動子序列的克隆1)

吳書景 池玉杰 閆洪波

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

錳過氧化物酶(MnP;EC1.11.1.13)是一種依賴H2O2的含F(xiàn)e3+的血紅素五聚體糖蛋白酶，同時(shí)也是一種常見的降解木質(zhì)素的過氧化物酶，廣泛存在于白腐菌中，在真菌降解木質(zhì)素的非特異性細(xì)胞外氧化還原酶中起著至關(guān)重要的作用。由于MnP對酚類和非酚類木質(zhì)素和多環(huán)芳烴等多種異生物質(zhì)都具有獨(dú)特的降解能力，它能夠有效地降解廢水和土壤中很難被降解的多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、DDT、染料、炸藥和其它氯化物等，因此這種酶在生物制漿、污水處理等生物技術(shù)應(yīng)用中具有重要意義。Lenzittes gibbosa是東北地區(qū)常見的一種白腐菌，也是一種生長速度較快、對木材和木質(zhì)素分解能力較強(qiáng)的白腐菌，筆者及其小組以前的研究表明這種白腐菌能夠產(chǎn)生錳過氧化物酶和漆酶［1］，并首先克隆到了該菌種的MnP基因［2］。筆者根據(jù)本研究小組已克隆到的L.gibbosa MnP1 cDNA全長基因Lg-mnp1，利用染色體步移法首先克隆到了Lg-mnp1上游的啟動子序列。對L.gibbosa MnP1基因Lg-mnp1啟動子的克隆有助于進(jìn)一步深入研究mnp表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，同時(shí)也為外源基因表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養(yǎng)

白腐菌(Lenzittes gibbosa)菌株CB1采自長白山，自行分離得到，保存在東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科森林病蟲病理實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)前在PDA斜面培養(yǎng)基上培育的菌種冷藏于4℃冰箱。挑取小塊試管內(nèi)的菌種，接種于PDA平板培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)7 d。

1.2 基因組DNA的提取

取長勢較旺的一皿菌絲體，刮取新鮮菌絲，使用TIANGEN公司的 DNAquick_快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)及相關(guān)方法提取真菌基因組DNA。將所得DNA取2 μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和大小，然后將DNA稀釋到終濃度為10～100 mg·L-1用于PCR反應(yīng)。

1.3 Lg-mnp1啟動子區(qū)域擴(kuò)增

根據(jù)已克隆到的L.gibbosa MnP1 cDNA全長基因Lg-mnp1，在 5'端設(shè)計(jì)了3個(gè)巢式特異性引物SP1、SP2和SP3，設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，SP2在SP1的上游，SP3位于SP2的上游。其中，SP1:5'-CGCAGCGTTCGTAGTGGTCT-3';SP2:5'-GCGAGGAGAGAAACGAAGGAAG-3';SP3:5'-ATTGTCGTTGTCTGATGAGGGATG-3'。利用染色體步移技術(shù)(Genome Walking Kit試劑盒，TaKaRa)克隆其上游的啟動子序列。PCR的擴(kuò)增體系、溫度條件和循環(huán)數(shù)見表1。擴(kuò)增完畢后，取第二、三輪PCR反應(yīng)液各2 μL，使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察電泳圖，確定目的條帶。使用Gel Extraction Kit(E.Z.N.A)試劑盒回收PCR產(chǎn)物的目的片段，再將DNA片段連接到 PMD20-T載體(TaKaRa)并轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中，所得菌液交北京英駿公司測序。將測定的序列去除載體后，與Lg-mnp1編碼區(qū)原始序列進(jìn)行拼接比對，確定為編碼區(qū)上游序列。采用 Signal Scan(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/)對克隆到的Lg-mnp1啟動子序列進(jìn)行分析［3-4］，確定其中的啟動子元件及核心區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.gibbosa MnP1基因Lg-mnp1的啟動子序列與分析

篩選第2輪和第3輪PCR產(chǎn)物的目的片段，測序后得到1 568 bp的序列如圖1所示，與Lg-mnp1編碼區(qū)原始序列進(jìn)行拼接比對，結(jié)果有90 bp的重疊，表明所得序列即為L.gibbosa MnP1基因Lgmnp1的啟動子序列。將該啟動子序列遞交Gen-Bank，登錄號為 HM369808。

表1 染色體步移PCR的擴(kuò)增體系、溫度條件和循環(huán)數(shù)

圖1 L.gibbosa MnP1基因Lg-mnp1的啟動子序列

啟動子序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，Lg-mnp1 5'端上游包含了真核生物啟動子的基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，見表2及圖1。在起始密碼子上游-83 bp處有1個(gè)TATA-box，-119、-196 bp有 2 個(gè)反向 CCAAT-box(ATTGG)。-92～43 bp為Lg-mnp1啟動子的基礎(chǔ)啟動子區(qū);在-52 bp處有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。也存在多個(gè)順式作用元件，包括SP-1(GGGCGG)、激活子蛋白AP-2位點(diǎn)(CCCMNSSS)、熱激元件HSE(5'-NTTCNNGAAN-3')［5］及6個(gè)推定的金屬響應(yīng)MREs(TGCRCNC)［6］等。

表2 Lg-mnp1啟動子包含的作用元件

2.2 白腐菌mnp基因啟動子元件的比較

將克隆到的白腐菌L.gibbosa MnP1基因Lgmnp1啟動子序列與前人研究的8種白腐菌16個(gè)mnp啟動子元件進(jìn)行了比較，結(jié)果見圖2。從圖2可知，盡管Lg-mnp1的調(diào)控元件與其他記載的白腐菌mnp有很多相似之處，但元件分布、數(shù)目及方向都有所不同。有些菌株mnp啟動子不包含MRE(如Lentinula edodes［7］)，而有些菌株 mnp 啟動子存在正向的CCAAT-box。

3 結(jié)論與討論

本研究的白腐菌(Lenzites gibbosa)與偏腫栓菌(Trametes gibbosa)是同物異名，起初Persoon將其命名為偏腫迷孔菌(Daedalea gibbosa Pers.)，后來由Fries轉(zhuǎn)屬作為 Trametes gibbosa(Pers.ex Fr.)Fr.，該命名后來一直被沿用。1939年，日本京都帝國大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物病理學(xué)研究室的逸見武雄(Hemmi Takewo)曾根據(jù)其子實(shí)體的形態(tài)特征，將其重新轉(zhuǎn)屬命名為 Lenzites gibbosa(Pers.)Hemmi［19］，但并未被采用。Tom?ovsky等［20］對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后，發(fā)現(xiàn)其與Lenzites屬的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系較近，遂認(rèn)定Lenzites gibbosa為該種的合法名稱。由于該種已經(jīng)轉(zhuǎn)屬到革裥菌屬，可將其中文名改為偏腫革裥菌，偏腫栓菌作為同物異名。

圖2 16個(gè)白腐菌mnp基因啟動子元件的比較

利用染色體步移法克隆了偏腫革裥菌Lg-mnp1啟動子序列，序列全長1 568 bp。經(jīng)啟動子在線分析軟件分析可知，該5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列包含了真核生物啟動子的基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件:1個(gè)TATA-box和2個(gè)反向的CCAAT-box(ATTGG)，以及多個(gè)重要順式作用元件，包括轉(zhuǎn)錄因子SP-1、AP-2、熱誘導(dǎo)因子HSE、金屬響應(yīng)因子MRE以及氮因子結(jié)合元件(GATA)等，這表明偏腫栓菌MnP在轉(zhuǎn)錄水平可能受氮源、錳以及熱休克調(diào)控，進(jìn)一步的證據(jù)有待于對其5'端調(diào)控區(qū)域進(jìn)行缺失分析研究。因此，對偏腫革裥菌Lg-mnp1啟動子的克隆，可為進(jìn)一步揭示mnp表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供啟動子序列基礎(chǔ)。再者，在構(gòu)建外源表達(dá)載體時(shí)，所應(yīng)用的可以是質(zhì)粒中的啟動子序列，也可以是自我基因的啟動子序列，這可根據(jù)試驗(yàn)對比的結(jié)果篩選哪一個(gè)啟動子序列更有利于該基因的外源表達(dá)。因此，對偏腫革裥菌L.gibbosa的錳過氧化物酶基因啟動子序列的克隆，也為其外源基因表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

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