鹿茸再生相關蛋白研究進展

王權威 董振 王桂武 楊福合 劉慧 李春義

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所　特種動物分子生物學國家重點實驗室，長春　130112）

鹿茸再生相關蛋白研究進展

王權威 董振 王桂武 楊福合 劉慧 李春義

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所特種動物分子生物學國家重點實驗室，長春130112）

鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠周期性再生的哺乳動物器官，它的生長速度極快卻沒有發(fā)生癌變。而蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，是生命活動的功能執(zhí)行者，鹿茸相關蛋白的研究是揭開鹿茸再生秘密的重要途徑。綜述了鹿茸再生相關蛋白的篩選、血管生成相關蛋白、軟骨形成相關蛋白、神經(jīng)再生相關蛋白以及其他與鹿茸再生相關蛋白的研究進展，旨在為從蛋白質(zhì)水平上揭示鹿茸再生過程提供基礎資料。

鹿茸再生相關蛋白；血管生成；軟骨形成；神經(jīng)再生

鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠完全再生的哺乳動物附屬器官［1］，生長速度極快卻沒有癌變。組織形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)［2，3］角柄骨膜（Pedicle periosteum，PP）是鹿茸再生必需的，鹿茸再生的生長中心也是由角柄骨膜細胞分化而來。而PP是由最初的生茸區(qū)骨膜（Antlerogenic periosteum，AP）直接衍生出來的。鹿茸發(fā)生的組織基礎是生茸區(qū)骨膜，即AP［4，5］。AP細胞和PP細胞不僅表現(xiàn)出了胚胎干細胞的一些特性，也具有多潛能性［4-8］。因此，AP細胞和PP細胞都是鹿茸干細胞，它們分別驅(qū)動了鹿茸發(fā)生和鹿茸再生。

研究發(fā)現(xiàn)，角柄骨膜遠心端1/3部分與皮膚結(jié)合緊密，受到角柄皮膚的作用而處于致敏狀態(tài)，正常生理條件下能夠發(fā)育成完整的鹿茸組織，Li等［9］稱之為角柄骨膜致敏區(qū)（Potentiated pedicle periosteum，PPP）；相應的近心端2/3與皮膚結(jié)合疏松部分并沒有被皮膚作用而處于休眠狀態(tài)，正常生理條件下不能再生出完整的鹿茸組織，Li等稱之為角柄骨膜休眠區(qū)（Distal pedicle periosteum，DPP）。因此，對于休眠區(qū)和致敏區(qū)的組織功能差異性研究是揭開鹿茸再生之謎的重要途徑。

雖然鹿茸周期性再生過程的組織學研究已經(jīng)有較好的基礎，但是鹿茸周期性再生的具體分子機制尚不清楚，激活鹿茸再生的關鍵蛋白或信號調(diào)控網(wǎng)絡尚未可知。因此，本文將從鹿茸再生相關蛋白篩選、血管生成相關蛋白、軟骨形成相關蛋白、神經(jīng)再生相關蛋白以及其他鹿茸再生相關蛋白等幾方面對鹿茸再生相關蛋白研究進展作一綜述，旨在為從蛋白質(zhì)水平上揭示鹿茸再生過程提供基礎資料。

1 鹿茸再生相關蛋白的篩選

鹿茸再生相關蛋白的篩選是找出鹿茸再生相關蛋白從蛋白質(zhì)水平上揭示鹿茸再生分子機制的基礎。目前，鹿茸再生相關蛋白篩選的主要途徑是鹿茸蛋白質(zhì)組學研究。Li等［10］對鹿茸AP細胞（APC）、PP細胞（PPC）以及面部骨膜細胞（FPC）3種細胞的蛋白質(zhì)組進行分析。結(jié)果表明在APC中鑒定得到了66種蛋白，而PPC中鑒定得到了98種蛋白。其中可能與鹿茸發(fā)生相關的蛋白有鈣結(jié)合蛋白（S100A4）、SPARC蛋白、轉(zhuǎn)移生長因子-1、COL1A1、白細胞介素8（IL8）、COL6A1、凝溶膠蛋白（GSN）、絲切蛋白1（CFL1）、原肌球蛋白（TPM2）、原肌球蛋白（TPM3）、POU5F1、SOX2、NANOG蛋白等。對結(jié)果進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt、ERK/MAPK、p38/MAPK等細胞信號通路在鹿茸干細胞增殖時起作用。

徐代勛等［11，12］對DPP與PPP的蛋白質(zhì)組進行比較分析與鑒定，發(fā)現(xiàn)PP1/3中存在著大量與生長和分化相關的生命活動。其中有6個與再生相關，即 PKM 2、MAPK1、PEDF、PRDX4、HSP90a和FBLN5，這些蛋白可能參與了鹿茸再生的相關分子調(diào)節(jié)與信號通路轉(zhuǎn)導。

趙東［13］和Gao等［14］也分別用不同蛋白提取方法對不同鹿茸組織進行了蛋白質(zhì)學研究，篩選出諸多鹿茸再生相關蛋白。

鹿茸蛋白質(zhì)組學研究已經(jīng)起步，為找到鹿茸再生關鍵蛋白奠定了基礎。但同時可以看出，不同時期、不同部位、不同樣品制備方法和不同分離鑒定技術所篩選出的與鹿茸生長發(fā)育相關蛋白的差異是很大的，這為尋找鹿茸再生關鍵蛋白帶來了一定的困難。而如何對篩選出的進一步的分析、篩選并驗證出鹿茸再生最關鍵的蛋白也是相關科研工作者必須面臨的問題。

2 鹿茸再生相關蛋白

2.1 血管生成相關蛋白

在一頭赤鹿的生茸周期中有數(shù)百萬角柄骨膜細胞的參與［15］。鹿茸生長最快的時候，能夠在兩個月內(nèi)生長發(fā)育為多種生理功能的成熟器官。這個過程中需要機體提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，排除代謝產(chǎn)物，這就要求鹿茸組織內(nèi)部必須含有強大的血管系統(tǒng)。研究已證實鹿茸中有一個完善的血管系統(tǒng)［16］，其血管來自于淺層顳颥動脈的分枝。

2.1.1 成纖維細胞生長因子2 成纖維細胞生長因子2（Fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2）也稱堿性成纖維細胞生長因子，活性FGF-2可以通過肝素硫酸鹽蛋白多糖與酪氨酸激酶受體性質(zhì)的FGFR結(jié)合，激活PKC、Ras/Raf/MEK/ERK、JAK/STAT和PI3K等信號傳導通路，而這些信號通路之間也有相互作用，同時FGF-2對這些信號通路的激活也受到一些細胞因子的調(diào)節(jié)，以上過程形成了復雜的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)機制，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、惡性轉(zhuǎn)化、損傷的修復以及血管發(fā)生等生理過程。在牛黃體溶解過程中，F(xiàn)GF-2抑制血小板反應蛋白（THBS1）的表達［17］，而血小板反應蛋白是抑制血管生成的，因此FGF-2能夠通過抑制THBS1的表達間接促進血管生成。Lai 等［18］研究發(fā)現(xiàn)FGF-2能夠通過誘導VEGF的表達，刺激和維持鹿茸中的血管形成和血管新生。

2.1.2 血管生長因子和多效生長因子 血管內(nèi)皮生長 因 子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在機體內(nèi)分布廣泛，有6個為亞型，在正常機體、病理性和腫瘤新生血管形成過程中起重要作用。其中VEGF-D可以作為診斷惡性腫瘤轉(zhuǎn)移性胸腔積液的一種標記物［19］。

多效生長因子（Pleiotrophin，PTN）是肝素結(jié)合蛋白超家族的成員。其在正常止血、血管再生、維持髓系和淋巴組織再生的平衡過程中起重要的調(diào)控作用，在血管老化的過程中，PTN能夠誘導血管新生［20，21］。

鹿茸的前軟骨區(qū)和軟骨區(qū)內(nèi)均有VEGF的表達，在前軟骨區(qū)的內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)了VEGF受體，在前軟骨區(qū)和血管平滑肌細胞有PTN的表達［22］。目前研究認為VEGF參與了鹿茸內(nèi)血管生成，而前軟骨區(qū)PTN基因的高表達表明PTN可能參與了血管生成和軟骨形成。前軟骨區(qū)均有VEGF和PTN的表達，它們在鹿茸血管再生過程中是否存在協(xié)同作用有待驗證。

2.1.3 血管生成素 血管生成素（Angiopoietin，Ang）是一個重要的促血管生成因子家族。在梅花鹿中有Ang-1和Ang-2的表達，Ang-1在間充質(zhì)層和前軟骨層、真皮層和過渡層、軟骨層內(nèi)的表達量逐次遞減，而Ang-2在真皮層和間充質(zhì)層內(nèi)表達量很高。因此，血管生成素可能在鹿茸的快速生長、鹿茸內(nèi)血管的快速形成、鹿茸軟骨的發(fā)育成熟等方面起重要調(diào)節(jié)作用。Li 等［23］研究發(fā)現(xiàn)剪應力可以通過wnt信號通路激活血管內(nèi)皮細胞中的Ang-2，進一步通過Wnt-Ang-2信號通路參與斑馬魚胚胎的血管發(fā)育和修復過程。VEGF和Ang在促進血管生成的同時，也會導致炎癥反應。不同的炎性細胞間通過自分泌或旁分泌作用與VEGF或Ang結(jié)合，反過來又可以為血管生成和成熟提供一個適宜的微環(huán)境［24］。

此外，在鹿茸和角柄骨膜中也存在著動物半乳糖凝集素1（Galectin-1）和色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，PEDF）。Galectin-1參與血管生成過程，而PEDF則被認為能夠抑制血管生成。

2.2 軟骨形成相關蛋白

鹿茸再生過程包括鹿茸發(fā)生、生長、血管生成、神經(jīng)再生及軟骨形成等過程。最初間質(zhì)細胞快速增殖，發(fā)育到一定程度以后間質(zhì)細胞開始分化為前軟骨細胞，前軟骨細胞再分化為軟骨細胞，至軟骨形成。

2.2.1 甲狀旁腺素相關肽 甲狀旁腺素相關肽（Parathyroid hormone-related protein，PTHrP）是一種堿性單鏈多肽。Kronenberg等［25］研究發(fā)現(xiàn)，PTHrP能在發(fā)育的骨骼調(diào)控軟骨細胞的分化。研究證實PTHrP在鹿茸的軟骨膜、間充質(zhì)層、軟骨祖細胞和鹿茸軟骨的血管周圍組織細胞中均有很高水平的表達，在覆蓋在骨組織上的骨膜和軟骨膜中也有表達，甚至被認為是鹿茸祖細胞的一個表型標記分子。在鹿茸中，PTHrP 能夠抑制軟骨細胞的分化卻促進其增殖，這就可以防止鹿茸軟骨細胞過早的肥大，保持增殖狀態(tài)，這對鹿茸軟骨的生長發(fā)育非常重要。在鹿茸再生過程中，PTHrP 還能夠刺激鹿茸破骨細胞的形成。因此，PTHrP對不同類型鹿茸細胞的分化均有調(diào)控作用。

2.2.2 轉(zhuǎn)化生長因子 轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factor，TGF）主要存在于成纖維細胞及上皮細胞內(nèi)。在骨的形成和重建中，TGF-β1能夠協(xié)調(diào)骨形成和重建中間充質(zhì)細胞、成骨細胞以及破骨細胞的活動。鹿茸頂部存在TGF-β1和TGF-β2的表達，鹿茸TGF能夠提高大鼠試驗性骨折的愈合速度，TGF可能參與了鹿茸再生過程中的軟骨細胞增殖和生長。此外，TGF-β能夠與經(jīng)典及非經(jīng)典Wnt信號通路協(xié)同誘導激活上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，使之維持間質(zhì)細胞狀態(tài)［26］。而鹿茸組織中軟骨細胞形成的最初始階段就是間質(zhì)細胞的快速增殖，因此TGF-β信號通路在鹿茸軟骨組織快速形成過程的分子機制及作用有待研究。

2.2.3 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morpho-genetic proteins，BMPs）是一類與胚胎骨骼形成有關的生長分化因子家族，是促進成骨的主要因子，對骨原細胞的分化起決定性作用。研究發(fā)現(xiàn)馴鹿中BMPs具有較高的骨形成活性［27］，且一定量的馴鹿BMPs和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白能夠有效誘導兔子橈骨骨折的愈合［28］。因此，BMPs可能參與了鹿茸再生過程中軟骨組織的生長發(fā)育。而BMPs又能夠誘導間充質(zhì)細胞分化為骨和軟骨，軟骨是鹿茸中最大的組織且鹿茸軟骨形成的初始過程就是間充質(zhì)細胞的快速增殖和分化，因此BMPs可能在鹿茸軟骨形成過程中發(fā)揮重要作用。

此外，表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）、神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）等多種生長因子也參與了鹿茸軟骨生成和發(fā)育過程。

2.3 神經(jīng)再生相關蛋白

鹿茸再生除了茸皮轉(zhuǎn)化、血管生成和軟骨形成外，還包括神經(jīng)組織的快速生長，神經(jīng)組織的生長速度甚至能夠達到1 cm/d。在鹿茸組織中，血管生成的區(qū)域一般都伴有神經(jīng)生成。

2.3.1 神經(jīng)生長因子 神經(jīng)生長因子（Nerve growthfactor，NGF）是神經(jīng)元再生、生長發(fā)育過程中的重要調(diào)控因子。NGF在赤鹿茸主干頂部、中部和根部3個部位均有表達，且含量遞減［29］。在赤鹿鹿茸中也發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)生長因子-3（Neurotrophin 3，NT-3）的表達［30］，且NT-3在鹿茸中的分布特點與神經(jīng)在鹿茸中的分布特點一致，即頂部表皮層高表達，軟骨層低表達。因此，NT-3可能與鹿茸再生過程中的神經(jīng)組織快速生長發(fā)育有關。此外，NGF主要存在于新生鹿茸的動脈和小動脈的平滑肌內(nèi)。在新生鹿茸神經(jīng)軸突形成以前，NGF能夠促進和維持血管生成，還能指引神經(jīng)織中的定向延伸［31］。因此，是否NGF就是導致鹿茸中神經(jīng)組織伴隨血管生成的主要因子有待進一步的研究。

2.3.2 可溶性半乳糖凝集素結(jié)合蛋白1 可溶性半乳糖凝集素結(jié)合蛋白1（LGALS1）是一種糖結(jié)合蛋白，是腫瘤發(fā)生的標志和治療靶標，具有調(diào)節(jié)骨骼肌生長和促進神經(jīng)組織生長等作用。研究發(fā)現(xiàn)LGALS1在APC和PPC中均有表達［10］。由于鹿茸中沒有肌肉組織，所以LGALS1在鹿茸再生中可能參與了神經(jīng)組織生長過程。LGALS1的表達受許多因子的影響，包括視黃酸（Retinoic acid，RA）。RA可以影響鹿茸再生的生長速度及位置信息，它在鹿茸再生中起著重要的作用。因此，LGALS1可能在鹿茸再生中起到重要作用。LGALS1蛋白可能調(diào)控MYC、MYCN和NANOG的表達等或者被其所調(diào)控，但有待證實。

此外，表皮生長因子能夠促進神經(jīng)干細胞生長分化。動物半乳糖凝集素1、色素上皮衍生因子和多效生長因子參與神經(jīng)修復、神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等過程。從鹿茸中提取出的一些多肽，如PAP、CNTP-I、CNTP-II、CNTP-III和CNT14等在促進神經(jīng)生長發(fā)育等過程起到一定作用。Garcia-Gutierrez等［32］研究發(fā)現(xiàn)PTN能夠間接提高誘導神經(jīng)元分化水平。

3 其他鹿茸再生相關蛋白

3.1 動物半乳糖凝集素1

動物半乳糖凝集素（Galectin-1，GAL-1）是動物半乳糖凝集素家族中的一員，可能參與了鹿茸再生的軟骨形成、血管再生以及神經(jīng)再生修復等過程。體外培養(yǎng)時，GAL-1在APC和PPC中的表達量遠高于FPC［33］。同時，研究發(fā)現(xiàn)GAL-1也存在于鹿茸尖端，GAL-1還在胚胎干細胞中起著重要的作用。因此，GAL-1是否在激活鹿茸發(fā)生和年復一年的再生過程中起作用是一個非常值得探究的命題。人體內(nèi)過表達一般會引發(fā)癌癥，鹿茸干細胞中GAL-1高表達卻并未引起鹿茸組織癌變，GAL-1在鹿茸干細胞中的研究至關重要。對其在鹿茸再生過程和腫瘤發(fā)生過程中的作用機制進行比對，將為腫瘤研究、預防和治療等方面提供新的理論指導。

3.2 胰島素樣生長因子1

胰島素樣生長因子家族（Insulin-like growth factors，IGF）包括IGF- I和 IGF2，是一類具有多種生理功能的因子，能夠介導生長激素的生長活性的啟動，對絕大多數(shù)的組織及特定類型的細胞生長、分化和分化后功能的維持進行調(diào)節(jié)。在快速生長的鹿茸中，IGF- I的表達水平也上升。IGF1不但與鹿茸生長有關，還與角柄的形成及鹿茸的骨化有關［34］。因此，IGF1可能參與了鹿茸再生的激活。Sadighi［35］證實了IGF具有刺激細胞分裂、促進細胞合成以及控制鹿茸生長的作用。IGF參與鹿茸生長發(fā)育、細胞增殖分化等諸多生理過程，是鹿茸再生過程中刺激其生長的主要生長因子。

3.3 色素上皮衍生因子和周期素依賴性蛋白激酶抑制物

Lord等［36］在快速生長的鹿茸茸尖中發(fā)現(xiàn)了兩個顯著的細胞周期調(diào)控因子：色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，PEDF）和周期素依賴性蛋白激酶抑制物（Cyclin dependent protein kinase inhibitor，CDKN1）。其中，在皮膚、軟骨和骨軟骨內(nèi)成骨等發(fā)育過程中均檢測到PEDF的mRNA，但只在前軟骨內(nèi)的不成熟的軟骨細胞中檢測到了CDKN1C的mRNA的表達。

PEDF參與神經(jīng)營養(yǎng)、抑制新生血管、抗腫瘤［37］等生理過程，具有抗炎以及抑制細胞凋亡等抗氧化活性。鹿茸在快速生長過程中，產(chǎn)生大量的活性氧族代謝產(chǎn)物，不及時清除可能會導致組織和細胞的死亡，PEDF的存在可以清除這些代謝產(chǎn)物，保證鹿茸正常的生長發(fā)育。

周期素依賴性蛋白激酶抑制物（CDKN1）是細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的重要成員，又稱作P21。CDKN1C是膠原類型X表達所必需的調(diào)控因子，可能對軟骨細胞分化具有直接作用。軟骨細胞增殖時，CDKN1C表達量下降，刺激PTHrP表達，進而刺激軟骨細胞的增殖。此外，CDKN1還具有細胞增殖分化、抗衰老和調(diào)控細胞凋亡的功能，能夠抑制癌癥發(fā)生。PEDF和CDKN1C是鹿茸生長過程中參與細胞增殖和分化的重要蛋白。

4 結(jié)語

鹿茸周期性再生的組織學基礎已經(jīng)有了答案，但是激活鹿茸再生的關鍵蛋白或信號網(wǎng)絡仍不得而知。從技術手段上看，蛋白質(zhì)組學最新技術手段仍沒有運用到鹿茸上；相關蛋白質(zhì)組學研究也沒能從鹿茸APC、PPP細胞、DPP細胞和FPC等方面進行全面的研究。信號通路網(wǎng)絡是解釋分子機制的重要途徑，研究鹿茸再生分子機制也可以從信號通路研究入手。對于已篩選出的可能與鹿茸再生相關蛋白質(zhì)的進一步分析、篩選以及功能驗證也是科研工作者需要面臨的問題。

對鹿茸再生過程各階段起重要作用的蛋白已有一些研究發(fā)現(xiàn)，但從鹿茸再生的各階段看，激活和誘導血管及神經(jīng)的生成，以及遷移過程的主要蛋白尚未找到。鹿茸中血管生成的區(qū)域一般都伴有神經(jīng)再生，所以神經(jīng)再生與血管生成的分子機制的關系有待研究。鹿茸中軟骨是主要組織，許多學者也找到了其調(diào)控過程的諸多蛋白，但是這些蛋白的具體分子機理和相互作用機制仍待進一步研究。

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［36］Lord EA， Martin SK， Gray JP， et al. Cell cycle genes PEDF and CDKN1C in growing deer antlers［J］. The Anatomical Record，2007， 290：994-1004.

［37］Hong H， Zhou T， Fang S， et al. Pigment epithelium-derived factor（PEDF）inhibits breast cancer metastasis by down-regulating fibronectin［J］. Breast Cancer Res Treat， 2014， 148（1）：61-72.

（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Proteins Related to Deer Antler Regeneration

Wang Quanwei Dong Zhen Wang Guiwu Yang Fuhe Liu Hui Li Chunyi
（State Key Lab for Molecular Biology of Special Animals/Institute of Special Animal and Plant Sciences，Chinese Academy of Agricultural Science，Changchun130112）

Deer antler is an only known mammalian organ that can periodically regenerate， and grow very rapidly without going cancerous. Proteins are the carrier and the function executor of life activities， the research of proteins related to deer antler is an important measure to unlock the secrets of antler’s regeneration. The proteins involved in angiogenesis， cartilage formation， nerve regeneration and other functions during antler regeneration are reviewed which aims at providing basic data for revealing antler regeneration process at the protein level.

proteins related to deer antler regeneration；angiogenesis；cartilage formation；nerve regeneration

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.004

2014-11-03

國家科技支撐計劃（2011BAI03B02），國家“973”計劃（2012CB722907），吉林省自然科學基金項目（201115129），吉林省科技支撐重點項目（20120965）

王權威，男，碩士研究生，研究方向：鹿茸干細胞膜蛋白質(zhì)組學；；E-mail：wangquanwei@yahoo.com

王桂武，男，博士，副研究員，研究方向：特種經(jīng)濟動物遺傳育種；E-mail：wangguiwu2005@163.com楊福合，男，博士，研究員，研究方向：特種經(jīng)濟動物種質(zhì)資源及遺傳育種；E-mail：yangfh@126.com