畜禽分子育種技術研究進展及趨勢

王嘉福

(貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025)

動物分子育種(Amimal Molecular Breeding)是依據(jù)分子遺傳學和數(shù)量遺傳學理論，利用DNA重組技術改良畜禽品種的新方法，內(nèi)容包括轉基因育種(Transgenic Breeding)和基因組育種(Genomic Breeding)等方面。近年來，隨著生物技術迅速發(fā)展，利用高通量測序、分子標記等先進的生物技術和信息技術手段，架起了種質(zhì)基因資源信息與高通量、大數(shù)據(jù)的橋梁，建立起常規(guī)育種與分子育種相結合的平臺，大幅度提高了育種效率，使育種工作實現(xiàn)了由“經(jīng)驗”向“科學”的根本性轉變。

1 畜禽分子育種技術的背景、現(xiàn)狀、趨勢

人類對畜禽的表型進行選擇以提高其生產(chǎn)性能是動物育種的重要內(nèi)容。孟德爾對遺傳規(guī)律的發(fā)現(xiàn)，開創(chuàng)了動物育種學的新時代。20世紀20年代，英國統(tǒng)計學家和遺傳學家費希爾、美國遺傳學家賴特及英國生理學家和遺傳學家霍爾丹奠定了數(shù)量遺傳學的理論基礎，1937年美國學者拉什出版了《動物育種方案》，初步奠定了現(xiàn)代動物育種的理論基礎(魯紹雄和吳常信，2002)。1950年代以來，數(shù)量遺傳理論逐漸應用到動物育種實踐中，并逐步成為主要的育種手段。從數(shù)量遺傳學誕生以來，畜禽育種工作取得了巨大的進展，畜牧生產(chǎn)水平也得到了極大的提高。然而進入1980年代以來，由于畜禽經(jīng)歷了相對長期的選擇，遺傳改良的速度呈現(xiàn)了變慢的趨勢，急需尋求一種具有突破性的育種方法。正是在這一時期，分子生物學，尤其是基因工程技術飛速的發(fā)展，以分子數(shù)量遺傳學為理論基礎的分子育種也隨之產(chǎn)生，DNA分子標記，即分子遺傳標記技術的成熟，使得畜禽數(shù)量性狀圖譜越來越系統(tǒng)化和完善，一些數(shù)量性狀位點已被確定，發(fā)現(xiàn)和鑒定了一批經(jīng)濟性狀關聯(lián)的DNA分子標記和功能基因，從而為畜禽改良提供了新的有效手段(Goddard and Hayes，2009，Hayes and Goddard，2001)。其中最主要的是如何利用分子遺傳標記對數(shù)量性狀基因型進行輔助選擇，即標記輔助選擇。分子標記輔助育種通過尋找與重要性狀緊密連鎖的DNA分子標記，從基因型水平上實現(xiàn)對目標性狀的直接選擇，從而加快育種進程，提高育種效率，選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種(Lande and Thompson，1990，Kashi et al.，1990，Tyrisev? et al.，2011)。

標記輔助選擇可提高畜禽育種效率。但是標記信息所能帶來的額外準確性主要取決于它能夠解釋的遺傳變異。畜禽遺傳改良的多數(shù)目標性狀都是數(shù)量性狀，受多個基因控制，每個基因只能解釋很小比例的遺傳變異。因此，通過候選基因(candidate gene)、數(shù)量性狀基因座定位(quantitative trait locimapping，QTLmapping)和全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS))(Do et al.，2013)等策略發(fā)現(xiàn)的基因或標記也只能解釋較小比例的遺傳變異。顯然，以上策略均難以顯著提高育種值估計的準確性，這些都限制了標記輔助選擇在畜禽育種中的應用。

人類基因組測序的完成推動了農(nóng)業(yè)動物基因組研究工作，如美國的動物基因定位計劃和國家動物基因組研究計劃，中國華大基因“千種動植物基因組計劃”等。動物基因組測序的完成和高通量基因分型技術的快速發(fā)展，出現(xiàn)了高密度的SNP芯片，產(chǎn)生了海量數(shù)據(jù)，極大促進了數(shù)量遺傳學的發(fā)展。隨著大多數(shù)畜禽物種高密度全基因組SNP分型芯片的開發(fā)和成本降低，為了將高密度全基因組標記信息更有效地用于遺傳改良，Meuwissen等(2001)首次提出了全基因組選擇(genomic selection，GS)方法，即全基因組范圍的標記輔助選擇(Marker Assisted Selection，MAS)，指通過檢測覆蓋全基因組的分子標記，利用基因組水平的遺傳信息對個體進行遺傳評估，以期獲得更高的育種值估計準確度。近年來，針對全基因組選擇的計算方法、影響因素、應用策略和育種方案的研究大量涌現(xiàn)，二代測序技術的發(fā)展，全基因組選擇方法已經(jīng)成為世界畜禽遺傳育種領域新的研究熱點(張哲等，2011);同時，計算機的飛速發(fā)展和分子數(shù)量遺傳學理論的進步，也為大批量數(shù)據(jù)的運算提供了技術支持。這兩者都促進了全基因組選擇方法由理論變?yōu)閷嵺`，借助于全基因選擇方法在動物育種中的應用，目前在農(nóng)業(yè)上全基因組選擇已極大地促進了動物育種和生產(chǎn)的發(fā)展。

全基因組選擇具有其無可比擬的優(yōu)勢，全基因組選擇是在全基因組層面上分析目標性狀表型的所有遺傳變異，能夠同時選擇多種經(jīng)濟性狀，從而達到多性狀選育的育種模式(Werf，2013)。全基因組選擇是動、植物育種的國際新趨勢。目前，基因組選擇處于大規(guī)模的理論研究和小規(guī)模實踐應用并行的階段。主要表現(xiàn)在，美國、加拿大、德國、荷蘭、丹麥、瑞士、澳大利亞等眾多國際前沿的研究機構都在集中開展高通量的SNP芯片檢測技術和高效的統(tǒng)計分析方法的研究，技術更新迅速，統(tǒng)計模型也在不斷優(yōu)化，育種值估計的準確性在不斷提高。另一方面，由于這一研究將帶來育種上的重大進展，具有重要的商業(yè)價值，國際上的大型育種公司已經(jīng)在部分商業(yè)品種中對全基因組選擇策略加以應用，以期占得技術先機。國際上兩家著名的芯片服務公司Illumina和Affymetrix正是看到了SNP標記檢測的廣闊前景，積極開發(fā)用于人、小鼠、果蠅等模式生物，以及經(jīng)濟作物和動物的SNP檢測芯片，并已經(jīng)投入商業(yè)使用。而目前隨著雞牛豬羊等農(nóng)業(yè)動物以及水產(chǎn)動物基因組序列圖譜及SNP圖譜的完成或即將完成，提供了大量的分子標記用于進行基因組研究。一些科研機構也在根據(jù)研究的需要，定制畜禽的SNP芯片。隨著分子生物學的發(fā)展，芯片的測序成本將會越來越低，密度將會越來越大，這都為基因組選擇提高了便利條件。

現(xiàn)代動物育種方法已逐漸從分子標記輔助選擇過渡到全基因組選擇育種。全基因組選擇方法的應用成為了繼20世紀四五十年代的雜交育種技術和90年代的BLUP技術之后的新的精準分子育種技術。

傳統(tǒng)育種技術與現(xiàn)代生物技術的交融，正在從深度與廣度上推進動物育種科學的發(fā)展(Flint and Woolliams，2008，Tyrisev?et al.，2011)。根據(jù)美、英等畜牧發(fā)達國家政府和聯(lián)合國糧農(nóng)組織的預測，21世紀全球商品化生產(chǎn)的畜禽品種都將通過分子育種技術進行選育，而品種對整個畜牧生產(chǎn)的貢獻率亦將超過50%。對于瘦肉生長和肉質(zhì)這類復雜性狀，用傳統(tǒng)選擇方法進行改良進展十分有限，而且會出現(xiàn)此起彼伏的現(xiàn)象，分子育種將有望成為新的育種手段。國內(nèi)外大型的育種公司已經(jīng)使用分子標記輔助選擇技術開展豬、牛等動物的遺傳改良，并加大研究投入和研究力度開發(fā)研制具有獨立知識產(chǎn)權的基因并應用于育種實踐，這已成為目前各國育種工作者研究重點(VanRaden and Sullivan，2010，Singh et al.，2014)。因此，應用分子育種技術來改良動物品種是21世紀品種改良的趨勢。

2 分子育種技術在動物性狀改造方面的應用

在動物的遺傳育種中，標記輔助選擇(MAS)的應用可使遺傳進展從15% 增加到30%，依據(jù)這種趨勢，MAS的總的遺傳進展估計可達到44.7%～99.5%(Edwards and Page，1994)。模擬研究表明采用標記輔助選擇比傳統(tǒng)指數(shù)選擇的理論相對效率可提高24倍(Bishop et al.，1995)。標記輔助選擇由于充分利用了表型系譜和遺傳標記的信息，與只利用表型和系譜信息的常規(guī)選種方法相比具有更大的信息量(魯紹雄和吳常信，2002)。目前MAS在動物的選育中已得到廣泛應用，由分子標記定位的控制動物重要經(jīng)濟性狀的主基因目前已檢測出了許多，1996年全球最大的豬育種集團PIC公司利用DNA標記技術清除其育種群中的氟烷敏感基因，使豬只死亡率由過去的4‰～6‰降至0，同時商品豬的肉質(zhì)也得到了明顯的改進;Hanset等(1995)已經(jīng)將大白豬的正常等位基因固定在皮特蘭豬中，并在3次回交后獲得氟烷陰性的皮特蘭品系。另一個成功例子是PIC公司在商業(yè)化瘦肉型豬繁育體系中導入中國梅山豬的高繁殖性能基因，將ESR基因型作為參數(shù)加入核心群母系選擇指數(shù)中，可以使產(chǎn)仔數(shù)的遺傳進展提高了30%，這些核心群母豬的后代雜種母豬平均窩產(chǎn)仔數(shù)也有明顯增加(Rothschild and Plastow，1999)。國際上其他豬育種公司也在應用DNA標記技術改良肉質(zhì)性狀等方面做了大量工作，都取得了明顯的效果(Dekkers，2004a，2012b)。法國、新西蘭和德國等將一些信息(連鎖平衡標記即LE標記)用于畜禽育種中，發(fā)現(xiàn)了很多與肉質(zhì)生長和繁殖性狀有關的基因，如與肉質(zhì)性狀有關的激素敏感脂肪酶基因(HSL)、鈣蛋白酶抑制蛋白基因(CAST)、豬氟烷基因(HAL)、基因豬熱激蛋白 70.2 基因(HSP70.2)、組織蛋白酶基因(CTSF)、心臟脂肪酸結合蛋白基因(H-FABP)及脂肪細胞脂肪酸結合蛋白基因(A-FABP)，與生長性狀有關的生長激素基因(GH)類胰島素因子I(IGF-I)和Myostatin基因等，與繁殖性狀有關的雌激素受體基因(ESR)、促卵泡素B亞基基因(FSH-B)、促乳素受體基因(PRLR)、豬表皮生長因子(EGF)基因和在綿羊上發(fā)現(xiàn)的Booroola基因，綿羊的多胎基因(FecB基因)定位于第6號染色體上，同時發(fā)現(xiàn)了一些與FecB基因相連鎖的分子遺傳標記。牛的雙肌(DM)基因和雞的矮小(dw)基因也在育種和生產(chǎn)中得到應用。對牛的初步研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因5＇端B型等位基因可能對牛的產(chǎn)犢性能有提高作用。這些基因控制的性狀在我國當前育種中尤為重要，利用標記輔助選擇具有十分重要的現(xiàn)實意義。

Genus-PIC(Genus Pic Annual Report，2013，傅衍，2014)是最早開展標記輔助育種的豬育種公司，在過去的二十年里，PIC研發(fā)及應用的分子標記在動物育種公司中是最多的，遺傳標記有關的專利有50多項，涉及的性狀有飼料利用率、疾病抵抗力、肉質(zhì)、生產(chǎn)性能和繁殖性能等，候選遺傳標記數(shù)量突破15000個、常規(guī)應用185個。近年來，PIC已從遺傳標記、候選基因的發(fā)掘和應用及標記輔助選擇，過渡到了全基因組連鎖分析及基因組選擇。PIC最新應用于育種實踐的研發(fā)成果是基因組評估中的“Imputation”技術(填充技術)，通過 Genus建立的Imputation技術，可以將對豬的400個SNP分型填充至6萬個SNP，從而使高密度基因組評估的成本從100美元下降至15美元，這使得基因組選擇真正成為了可大量應用于豬育種實踐的實用技術。Genus研發(fā)團隊正在從事的有潛在應用前景的其它研究有:公畜生產(chǎn)單性別精液技術(非物理和化學方法)、通過生殖細胞轉移讓普通公豬生產(chǎn)超級公豬精液的技術、以及基因編輯技術等。

根據(jù)國際牛協(xié)(Interbull Centre Activity Report，2013/2014)統(tǒng)計，目前，在許多國家用基因分型的方法對奶牛的表型和家系進行選擇。全世界超過50，000頭奶牛進行了50，000個標記的基因分型，奶牛的選擇育種已從遺傳學向全基因組選擇轉變。

在我國，前期的大量工作已為主要畜禽基因組選擇的實施鋪平了道路。如在我國的奶牛育種中，隨著近年來奶牛生產(chǎn)性能測定(DHI)體系的建立和完善，已積累了大量可靠的生產(chǎn)性能測定數(shù)據(jù)，這為估計SNP標記效應奠定了基礎;另外在雞，豬的研究中，已檢測出大量針對我國特有品種的SNP標記，為定制這些畜種SNP芯片提供了條件。同時在單倍型推斷和育種值估計方面，國內(nèi)已開展了大量相關研究工作，這些都為我國畜禽基因組的選擇的開展提供了不可多得資源優(yōu)勢和技術支持。在國際上，新西蘭已經(jīng)減少了后裔測定公牛數(shù)目，增加了基于基因組信息選擇種公牛數(shù)目。而且一旦參考群體被確定以后，低密度的基因分型能夠降低未來基因分型的費用。獲得基因結果以后，母牛和年輕公牛有著比基于系譜信息估計的育種值更高的準確性。2010年，Macciotta等(2010)借助50K芯片在美國安格斯牛上對屠宰性狀進行基因組育種值估計，結果表明準確性在0.50-0.65。Saatchi等(2012)在美國利木贊和西門塔爾肉牛上實施基因組選擇，他們的參考群體是由2239頭利木贊和2703西門塔爾牛，基因分型使用的是Illumina的50k芯片，分析了多個重要的經(jīng)濟性狀，研究結果表明基因組育種值有較高的準確性(Saatchi et al.，2012)。另外，美國等正在研究將全基因組選擇等新技術引入到奶牛育種體系中，降低后裔測定和種公牛選種在現(xiàn)有育種體系中的重要性，進而消除雜交育種帶來的品種不純等負面影響，而合理利用雜交育種帶來的雜種優(yōu)勢。在豬的育種中，雜交是被廣泛使用的，這樣充分利用雜種優(yōu)勢和品種互補，使用雜種豬作為參考群體進行基因組選擇來進行選擇純種豬，這能夠允許進行一個更有效的選擇。在家禽育種中，Wolc等(2011)在蛋雞上使用了基因組選擇，研究結果表明基因組選擇在蛋雞早晚期選擇中能夠顯著地提高準確性。Gonzalez等(2009)在肉雞群體中實施基因組選擇，他們選用333只和61只后裔測定的公雞分別作為參考群體和驗證群體，對肉雞的飼料轉化率進行了研究。在水產(chǎn)動物中，挪威大西洋鮭魚育種公司(Aqua Gen)聯(lián)合 Affymetrix公司，設計了包含 923，627 SNPs的高密度芯片，計劃開展大西洋鮭魚抗病和寄生蟲等經(jīng)濟性狀的分子育種研究?？偟膩碚f，目前基因組選擇在豬、羊、雞以及水產(chǎn)動物中的研究報道還較少，應用范圍不及奶牛廣泛。

3 分子育種技術在動物種業(yè)領域的主要任務和發(fā)展重點

標記輔助選擇由于充分利用了表型、系譜和遺傳標記的信息，與只利用表型和系譜信息的常規(guī)選種方法相比，具有更大的信息量。同時由于標記輔助選擇不易受環(huán)境的影響，且沒有性別、年齡的限制，因而允許進行早期選種，可縮短世代間隔，提高選擇強度，從而提高選種的效率和準確性，尤其是對于限性性狀、低遺傳力性狀及難以測量的性狀，其優(yōu)越性就更為明顯(Lande and Thompson，1990，Xie and Xu，1998)。從理論上而言，MAS改良數(shù)量性狀比常規(guī)表現(xiàn)型選擇有效的多，但實際育種中應用并不理想，其原因是QTL定位與效應的估算精確度不高，并且QTL與分子標記的關聯(lián)性，因群體和世代不同而異。動物多數(shù)經(jīng)濟性狀為復雜的數(shù)量性狀，發(fā)育過程中涉及到眾多的基因表達調(diào)控及其相互作用。分子標記不是基因，其變異并不能完全解釋性狀的遺傳變異，此外基因型與環(huán)境互作也是重要影響因素。而目前的MAS方法大多基于簡單加性模型或單基因座雙基因座模型，還不能分析基因型與環(huán)境的互作和上位效應以及性狀在不同時空表達的復雜遺傳現(xiàn)象。目前國內(nèi)外有大量關于動物的一些重要經(jīng)濟性狀QTL作圖的報導，但尚沒有應用QTL進行輔助選擇的報導。為此開展能分析復雜數(shù)量性狀的遺傳模型，并探討其在育種實踐中應用十分必要。

目前要做的是利用分子標記圖譜發(fā)掘QTL資源，從整個基因組水平上進行QTL定位，探索其效應大小、作用方式等。發(fā)展基于QTL圖譜的標記輔助選擇的新方法，逐步建立完善抗病抗逆高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等重要性狀相關基因標記的篩選及其輔助育種技術。隨著各國動物基因組計劃的深入開展，許多影響畜禽重要經(jīng)濟性狀的QTL已經(jīng)或正在被成功定位，人們對標記輔助選擇的研究也將不斷深入，標記輔助選擇也必將在未來的動物育種改良中發(fā)揮出更加重要的作用。

近10年來，動物全基因組標記輔助選擇策略是育種工作者們關注的焦點和熱點，也被認為是精準估計育種值的最佳方案，雖然這一方案在試驗及分析技術方面已經(jīng)比較成型，并且在奶牛、肉雞育種中得到了應用，但實際上它的技術成熟度還遠遠不能滿足商業(yè)需求，面臨著在理論和實際應用方面諸多難題。因此全基因組選擇技術在動物種業(yè)領域的主要任務和發(fā)展重點應包括一下幾個方面:

①SNP檢測的成本是全基因組選擇大規(guī)模的在動物種業(yè)領域應用的重要限制條件，因此應提高全基因組選擇檢測的效率，縮短檢測時間，革新SNP芯片制作技術，降低芯片制作技術成本，通過優(yōu)化檢測技術，提高芯片的利用效率，使得全基因組選擇能夠得到廣泛應用。

②在數(shù)據(jù)挖掘方面，高密度SNP芯片同樣是育種學家面臨的挑戰(zhàn)。主要集中于與如何對SNP進行準確的單倍型推斷，更多的利用標記信息;以及如何估計單倍型及SNP的遺傳效應，使之成為育種值準確估計的依據(jù)?；蛐瓦x擇的核心思想是估計出覆蓋整個基因組的SNP的單倍型效應，每個染色體區(qū)段上單倍型效應的累加即個體的基因組估計育種值，因此單倍型效應估計的準確性顯得十分重要。當前大部分基因組選擇理論方面的研究仍假定單倍型已知，而在實際應用中，單倍型很難通過實驗方法檢測到，更多是利用統(tǒng)計學方法進行推斷。雖然已有正對家養(yǎng)動物的單倍型推斷方法，但它們都存在局限性，因此建立針對主要畜禽不同實驗設計的單倍型推斷方法，提高單倍型效應分析準確性，構建一套適合全基因組SNP標記的單倍型推斷方法尤為必要。

③開展雞牛豬羊等農(nóng)業(yè)動物以及魚類(鲆鰈魚類、鯉科魚類等)和貝類(牡蠣、扇貝等)參考群體的構建、全基因組重測序、SNP標記批量發(fā)掘和抗病等重要性狀相關分子標記篩選、SNP標記與重要性狀關聯(lián)分析及其遺傳效應值評估、基于全基因組選擇的系譜信息分子矩陣及遺傳算法等技術研究，研制重要動物基因分型用的高密度全基因組SNP芯片和育種用的低密度SNP芯片，建立動物全基因組選擇育種技術。

④建立分子育種設計技術，構建重要農(nóng)業(yè)動物抗病、高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)等重要性狀相關基因調(diào)控網(wǎng)絡，構建重要性狀關鍵基因功能驗證及其互作網(wǎng)絡，以及重要經(jīng)濟性狀的G-P模型的建立，研究不同個體關鍵基因和優(yōu)良性狀聚合技術。

4 對策措施與政策建議

基因組選擇在動物育種中有很大優(yōu)勢，能夠加快動物遺傳育種進展，它也向人們表明了在基因組時代，計算技術和分子生物學技術已經(jīng)在動物遺傳改良中發(fā)揮著巨大的作用?？梢灶A期隨著生物技術和計算技術的不斷進步，基因組選擇方法將會在動物遺傳育種領域得到廣發(fā)應用，且必將為動物育種學研究帶來深遠的影響。

全基因組SNP標記輔助選擇策略正在成為現(xiàn)實，這一技術在奶牛和肉雞的商業(yè)育種中得到了應用，當前實施全基因組選擇技術進行育種還存在一定的硬件限制，因為目前開展全基因組選擇技術成本依然很高，降低全基因組SNP芯片成本，革新SNP芯片制作技術，提高分析鑒定技術，建立簡單規(guī)范的操作體系，是首先應解決的問題。同時全基因組選擇過程中需要對數(shù)萬個標記的效應進行估計，其算法比較復雜，亟需建立簡單的單倍型的推斷方法和育種值估計方法，并且需要具有相關知識的研究人員和高性能的計算機或服務器才能完成這種海量數(shù)據(jù)計算，因此，在實際育種中運用全基因組選擇需要配套技術和完善設備。建議采取使用Tag SNP進行選擇或使用中等密度的SNP圖譜進行輔助選育，這樣可以相應地降低分型檢測的成本，提高效率。隨著基因分型技術的發(fā)展和成本的降低，可以逐漸地提高SNP位點的密度，提高精確度，為畜禽新品種的快速培育提供重要指導。

同時，如何優(yōu)化已有的全基因組技術平臺，建立完善的“群體設計——分子檢測——標記效應評估——精準估計育種值——選種”的技術體系，為畜禽新品種的快速培育提供重要指導，仍然需要深入的探索和研究。

目前我國的畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)育種起步晚，技術水平不高，缺乏進行全基因組選擇等前沿技術研發(fā)的技術力量和平臺條件。因此，全基因組選擇等育種前沿技術的研發(fā)應該由國家級科研機構或高等院校牽頭、聯(lián)合水產(chǎn)育種企業(yè)協(xié)同攻關來進行，形成產(chǎn)學研一條龍的研究格局有利于充分發(fā)揮各方的優(yōu)勢、有利于前沿技術的及時轉化和應用。

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