畜禽宰后肌肉嫩化相關(guān)酶研究進(jìn)展

李晶晶，張瑞紅，韓冬雪，俞龍浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

畜禽宰后肌肉嫩化相關(guān)酶研究進(jìn)展

李晶晶，張瑞紅，韓冬雪，俞龍浩*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

目前普遍認(rèn)為參與宰后肌肉嫩化的相關(guān)蛋白酶主要有溶酶體組織蛋白酶、蛋白酶體、鈣激活蛋白酶、鈣激活酶抑制蛋白和半胱天冬酶5 種，然而對于成熟過程中肉的嫩化程度及機(jī)理頗具有爭議。大量的研究表明，上述5 種嫩化酶在參與肉嫩化過程中其自身生理生化特性在宰后也發(fā)生變化。本文綜述5 種參與宰后肉嫩化酶的分子質(zhì)量、存在部位、作用底物、作用位點(diǎn)、激活條件、最適pH值以及對其活性具有一定影響的抑制劑，并就其影響宰后肉嫩度的作用機(jī)理及其自身狀態(tài)的變化進(jìn)行分析與闡述，旨在為后續(xù)研究嫩化酶在宰后改善肉嫩度方面的應(yīng)用條件提供參考。

宰后嫩化；蛋白酶；生理生化

畜禽宰后肌肉在貯藏過程中發(fā)生生理生化變化，嫩度和風(fēng)味隨之逐漸改善，進(jìn)而將肌肉轉(zhuǎn)變?yōu)槿?。在所有的肉的特性中，嫩度是與食用品質(zhì)有關(guān)的最重要的因素［1］，也是消費(fèi)者對肉品質(zhì)最為直接的感官評價標(biāo)準(zhǔn)。大量研究表明，肉的最終嫩度取決于宰后肌肉結(jié)構(gòu)及各類肌蛋白變化程度［2］。總體來講，肉的嫩化過程就是一個在內(nèi)源酶的作用下肌纖維結(jié)構(gòu)和結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的完整性減弱的過程。在肉的僵直成熟過程中，參與肉嫩化過程的酶系統(tǒng)［3-4］主要為鈣激活蛋白酶系統(tǒng)和溶酶體組織蛋白酶系統(tǒng)，其中在畜禽動物宰后初期，通常主要考慮鈣激活蛋白酶系統(tǒng)對肉嫩度的影響。然而肉的嫩化過程及程度并不僅是由單一的蛋白水解酶系統(tǒng)決定的，而是由一個多酶復(fù)合體系共同參與完成的。本文介紹溶酶體組織蛋白酶、蛋白酶體、鈣激活蛋白酶、鈣激活酶抑制蛋白和半胱天冬酶5 種嫩化酶，重點(diǎn)闡述這5 種嫩化酶的生理生化特性及宰后變化，以期為探明這5 種蛋白酶是否可以進(jìn)一步參與宰后肉的嫩化過程及其影響程度提供參考依據(jù)。

1　溶酶體組織蛋白酶

溶酶體組織蛋白酶是由肽鏈外切酶和肽鏈內(nèi)切酶組成的一組酶，屬于天冬氨酸和絲氨酸肽酶家族系統(tǒng)［5］。包括半胱氨酸型組織蛋白酶B（cathepsin B）、天冬氨酸型組織蛋白酶D（cathepsin D）、組織蛋白酶H（cathepsin H）和組織蛋白酶L（cathepsin L）4 種類型。

Cathepsin B分子質(zhì)量范圍為23～29 kD，大部分存在于肝臟溶酶體中，以N-芐酯基-L-精氨酰-L-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素為底物進(jìn)行催化。其活性的表現(xiàn)需要半胱氨酸或者2-巰基乙醇存在，后者的激活效果沒有前者好。作用位點(diǎn)為肌漿中的肌球蛋白、肌動蛋白以及肌原纖維骨架中的肌鈣蛋白-T。Cathepsin B的抑制劑有碘醋酸、氨基碘乙酰、TLCK、TPCK及E64等。Cathepsin B活性最適pH值在5.5～6.0左右，最適的溫度是37 ℃。

Cathepsin D存在于大部分肌肉溶酶體中，可以使用ESO10（MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2）和酸變性牛血紅蛋白作為底物。作用位點(diǎn)有肌聯(lián)蛋白、肌球蛋白、C-蛋白、M-蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白-T、肌鈣蛋白-I及原肌球蛋白，另外抑肽素對組織蛋白酶D有獨(dú)特的專一性抑制作用。Cathepsin D活性在pH值為3.0～4.5、壓力520 MPa、260 s、溫度為10 ℃條件下最高。

Cathepsin H分子質(zhì)量為28 kD，存在于骨骼肌溶酶體中，底物為N-芐酯基-L-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素。其作用位點(diǎn)是肌球蛋白，當(dāng)pH值為7.0，溫度到達(dá)20 ℃時有最高作用效果。

Cathepsin L分子質(zhì)量為24 kD，位于骨骼肌溶酶體中，作用底物為N-芐酯基-苯丙氨酸-精氨酸-7酰胺基-4-甲基香豆素。作用位點(diǎn)有肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌鈣蛋白-T及α-輔肌動蛋白。最適pH值在5.5左右。當(dāng)以肌球蛋白為底物，pH值為4.1時活性最高。Cathepsin L的抑制劑有亮肽素和抗蛋白酶。

組織蛋白酶居于全身各處肌漿液的溶酶體中，在腎、脾、肝臟中含量較高，骨骼肌中含量較少。在畜禽肉宰后pH值小于7，因此在正常情況下cathepsin H不能降解肌原纖維蛋白。Ouali等［6］認(rèn)為cathepsin D在pH值小于5的情況下可以對肌原纖維蛋白有降解的作用，但是在宰后肌肉的成熟過程中所達(dá)到的pH值的極限為5.5，此條件下cathepsin D對肌原纖維的降解能力很小。

目前研究最為廣泛的是cathepsin B、cathepsin L，也是通常被認(rèn)為參與宰后肉嫩度的2 個重要的蛋白酶。Appaiahgari［7］、Cruzen［8］和張瑞紅［9］等發(fā)現(xiàn)在宰后成熟階段較高溫度和較低pH值能加快溶酶體的裂解，使溶酶體破裂，釋放出cathepsin B，繼而參與宰后肉的分解。但在宰后肉的成熟過程中，所達(dá)到的pH值極限為5.5左右，達(dá)不到溶酶體破裂所需要的pH 5的條件。Iwanowska等［10］對牛肉嫩度的研究表明，在宰后成熟8 h，cathepsin B和cathepsin L參與宰后牛的嫩化，cathepsin L降解肌聯(lián)蛋白、原肌球蛋白、伴肌動蛋白、以及肌鈣蛋白-T、C以及I，這些符合宰后成熟時發(fā)生的肌原纖維降解模式。而且與Mikami等［11］對兔肉、雞肉以及牛肉的背最長肌的組織蛋白酶L是否參與宰后肉的嫩化過程的研究結(jié)果相一致。

通過宰后肌肉生理生化水平，根據(jù)研究數(shù)據(jù)分析，由于宰后pH值的極限為5.5，宰后肌肉中的cathepsin B是否能從溶酶體中破裂出來，作用于肌原纖維，目前尚存在爭議［12］。另外，從肌肉宰后的作用底物來看，肌漿中沒有大規(guī)模的cathepsin B的作用底物分解，因而不能立即得出cathepsin B是否參與宰后肌肉的嫩化的結(jié)論。目前大多數(shù)研究者宰后肌肉生理變化水平上的研究結(jié)果表明，cathepsin L有可能參與宰后肌肉 嫩化，同時也得出結(jié)論：cathepsin L的活性程度與肉的種類無關(guān)。鑒于目前對于組織蛋白酶是否參與宰后肉的嫩化過程還是不確定的，需要進(jìn)一步的研究和探討。

2　蛋白酶體

蛋白酶體是所有真核生物中負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)垃圾，除了溶酶體以外的一種水解體系，對蛋白質(zhì)的降解通過泛素進(jìn)行傳遞，又稱為泛素降解途徑。泛素是由76 個氨基酸組成的小肽，它的作用主要是識別要被降解的蛋白質(zhì)，然后將這種蛋白質(zhì)送入蛋白酶體中心進(jìn)行降解。蛋白酶體對蛋白質(zhì)的降解分為兩個過程：一是對被送入到蛋白酶體中心的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，由泛素完成；二是蛋白酶解作用，又叫做蛋白酶體催化［13］。

蛋白酶體的組分形式通常根據(jù)蔗糖梯度離心法測定的斯維德伯格沉降系數(shù)（以“S”來標(biāo)記）來命名，最普遍的蛋白酶體的組分形式是26S蛋白酶體，其分子質(zhì)量約為2 000 kD，包括1 個20S核心顆粒和2 個19S調(diào)節(jié)亞基顆粒。已知20S是一種多催化蛋白酶復(fù)合體，分子質(zhì)量為750 kD，是這些蛋白酶體復(fù)合物的催化核心，具有催化蛋白質(zhì)水解酶活性。19S調(diào)節(jié)亞基中含有多個ATP酶活性位點(diǎn)和泛素結(jié)合位點(diǎn)，用來識別多泛素化的蛋白質(zhì)，并將它們傳送到核心顆粒中，進(jìn)行催化降解。

蛋白酶體在體內(nèi)普遍存在，并且大量存在于骨骼肌中。蛋白酶體中包含糜蛋白酶、胰蛋白酶、谷氨酰肽水解酶、支鏈氨基酸以及小中性的氨基酸。由于在20S核心顆粒中主要包含3 個活性位點(diǎn)β-1、β-2和β-5，而這3 個活性位點(diǎn)分別對應(yīng)負(fù)責(zé)糜蛋白酶、胰蛋白酶與谷氨酰肽水解酶的活性，因此在宰后畜禽肌肉中研究應(yīng)用最為廣泛的為糜蛋白酶、胰蛋白酶和谷氨酰肽水解酶。這3 種蛋白酶的3 種特異性水解底物都具有細(xì)胞通透性，當(dāng)它們進(jìn)入細(xì)胞后，對底物的特異氨基鏈進(jìn)行識別，并可以進(jìn)一步對底物的特異氨基酸鏈進(jìn)行切割，被切割后的底物釋放出游離的發(fā)光基團(tuán)，可以通過熒光進(jìn)行監(jiān)測這些蛋白酶是否參與畜禽肌肉宰后的變化。

在生理?xiàng)l件下，蛋白酶體在細(xì)胞內(nèi)主要負(fù)責(zé)降解各種結(jié)構(gòu)異常、短生命周期的蛋白質(zhì)，是非溶酶體蛋白質(zhì)降解途徑中的重要蛋白酶。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為蛋白酶體能夠參與牛［14-17］、豬等大型物種的宰后肉嫩化過程，而對于較小的物種，如羊［18］、小鼠［19］等，許多學(xué)者對此提 出質(zhì)疑。目前對于蛋白酶體是否參與宰后肉的嫩化過程及其是否與物種相關(guān)尚未定論，仍需進(jìn)一步研究，但是并不能排除蛋白酶體參與宰后蛋白質(zhì)降解的可能。

3　鈣激活蛋白酶系統(tǒng)

鈣激活蛋白酶也叫鈣激活中性蛋白酶，簡稱鈣激活酶，是目前肉類科學(xué)中可能研究最為廣泛的蛋白酶家族。并且大多數(shù)人都接受鈣激活酶系統(tǒng)參與肉嫩化的學(xué)說［3］。鈣激活酶是細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶的一個大家族。在骨骼肌中，鈣激活酶分為μ-calpain，m-calpain和calpastatin 3 種。

鈣激活酶（calpain）是一種鈣催化蛋白酶，需要Ca2+激活。當(dāng)Ca2+濃度為微摩爾級別時，μ-calpain被激活，當(dāng)Ca2+濃度為毫摩爾級別時，m-calpain被激活。其中μ-calpain和m-calpain位于骨骼肌內(nèi)部，肌原纖維的Z線連接處，具有一個28 kD的小亞基和一個80 kD的大亞基，作用位點(diǎn)有肌鈣蛋白-T、肌聯(lián)蛋白、肌間線蛋白（Z線）、連接蛋白、原肌球蛋白以及伴肌動蛋白［10］。當(dāng)μ-calpain達(dá)到半數(shù)活性時，Ca2+濃度約為5～50 μmol/L，m-calpain達(dá)到半數(shù)活性時，Ca2+濃度約為250～1 000 μmol/L。m-calpain最適的pH值范圍為6.1～7.5。由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的波動在微摩爾濃度水平以下，所以認(rèn)為μ-calpain可能在正常生理?xiàng)l件下發(fā)揮功能，而m-calpain則可能在細(xì)胞內(nèi)鈣超載等病理?xiàng)l件下被激活［20-22］。

Huff等［23］用calpain體外培養(yǎng)肌原纖維，降解了主要肌纖維蛋白，包括伴肌動蛋白、肌聯(lián)蛋白、肌鈣蛋白-T以及結(jié)蛋白，這與體內(nèi)肌原纖維降解模式相同。另外，Boehm等［24］研究發(fā)現(xiàn)宰后牛肉中激活μ-calpain所需要的Ca2+濃度比m-calpain活化所需要的濃度低，因此宰后牛肉中μ-calpain先被激活。然而Geesink等［25］將小鼠基因中的μ-calpain基因敲除后，觀測到蛋白質(zhì)的水解程度大幅度下降，但是，也觀測到還有大部分的蛋白質(zhì)降解，這表明可能是由于其他蛋白酶對蛋白質(zhì)分解起到了作用。

鈣激活酶抑制蛋白（calpastatin）是與calpain相關(guān)的特異性內(nèi)源性抑制劑，位于骨骼肌內(nèi)部［26］，肌原纖維的Z線連接處，分子質(zhì)量為130 kD。當(dāng)Ca2+濃度小于5～50 μmol/L時，能夠與calpain結(jié)合，抑制calpain活性，同時本身可降解分裂成100 kD和70 kD的片段。其最適pH值為6.1左右，當(dāng)pH＜5.5時，抑制作用減弱。Calpastatin對μ-calpain及m-calpain活性的抑制作用依賴于Ca2+濃度，激活calpastatin所需要的Ca2+濃度接近或低于激活μ-calpain所需要活化的濃度。如果被激活的calpain附近有calpastatin存在，calpastatin將迅速與calpain結(jié)合來抑制calpain的活性［27］。此外，calpastatin與calpain的這種結(jié)合是可逆的，Ca2+濃度不足時兩者會自動發(fā)生分離。與嫩度相關(guān)性最高的是calpastatin與μ-calpain的活性比值，比值越小肉的嫩化效果越好［28-29］。

畜禽屠宰后，機(jī)體正常生理?xiàng)l件遭到破壞，溫度和pH值下降會造成calpain系統(tǒng)的酶活性下降。但是，肌肉內(nèi)ATP能量逐漸消失和pH值下降又會使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂，升高細(xì)胞中Ca2+濃度，這又會大幅度地激活calpain系統(tǒng)中蛋白酶的活性。本研究團(tuán)隊(duì)通過酪蛋白酶譜法測定宰后肌肉不同處理對calpain活性的變化發(fā)現(xiàn)，μ-calpain在處理組之間沒有差異，這可能是由于calpastatin抑制了μ-calpain的活性結(jié)果。從而推測引起兩種不同處理組之間產(chǎn)生的顯著嫩化差異可能是μ-calpain以外的某種酶引起的結(jié)果（此研究結(jié)果待發(fā)表）。至于那些酶引起宰后肌肉不 同處理組之間的嫩化差異以及其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4　半胱天冬酶家族系統(tǒng)

盡管有相當(dāng)多的證據(jù)表明在宰后早期calpain系統(tǒng)的活性影響肉最終嫩度，同時也表明這不是肉品質(zhì)蛋白水解唯一的決定因子［30］。近年來有研究學(xué)者提出半胱天冬蛋白酶（Caspase）可能對畜禽動物宰后肉的嫩化具有一定的作用。Caspase是半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶族。迄今為止，半胱天冬酶家族的14 名成員（1～12以及mICH 3和mICH 4）已經(jīng)被鑒定出來。

Caspase-1，作用位點(diǎn)YVAD，作用底物為pro-IL-I、pro-caspase-3、pro-caspase-4。醛化的YVAD（ACYVAD-CHO）是Caspase-1的特異可逆抑制劑，酰酮化YVAD（Ac-YVAD-CMK）是特異性不可逆抑制劑。當(dāng)Caspase-1的天冬氨酸位點(diǎn)的2 個亞基連接區(qū)被切割后，產(chǎn)生異二聚體，Caspase-1才具有活性。Caspase-2的分子質(zhì)量為48 kD，能使作用底物PARP（116 kD）分解成31 kD和85 kD；Caspase-3的分子質(zhì)量為32 kD，作用底物為PARP、DNA-pk、SRE、BP、rho-GDI、kc，作用位點(diǎn)是DEAD；Caspase-6作用底物為LaminA，作用位點(diǎn)是VEID；Caspase-7的分子質(zhì)量為35 kD，作用底物為PARP、pro-caspase-6，作用位點(diǎn)是DEVD；Caspase-8的分子質(zhì)量55 kD，作用底物為pro-caspase 3、4、7、9、10，作用位點(diǎn)是DEVD；Caspase-9的分子質(zhì)量為46 kD，作用底物為PARP；Caspase-10的分子質(zhì)量為55 kD，作用位點(diǎn)是YVAD；Caspase-11的分子質(zhì)量為42 kD。

目前只有以上7 個Caspase酶被確定參與細(xì)胞凋亡途徑，這些酶在最初都是以無活性酶原形式存在，因此需要通過水解其氨基端一段序列而進(jìn)一步激活。

Caspase家族成員大多數(shù)是細(xì)胞凋亡的啟動子或效應(yīng)子，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Earnshaw等［31］認(rèn)為Caspase-2、8、9、10作為Caspase酶的啟動子，Caspase-3、6和7是Caspase效應(yīng)子，在細(xì)胞死亡途徑上起作用。Boatright等［32］報道激活Caspase主要通過3 個方式：1）細(xì)胞死亡途徑，也稱外部途徑，當(dāng)細(xì)胞表面受體受到激發(fā)，與此同時Caspase-8和Caspase-10啟動子啟動，兩者通過這個方式活化，隨后激活下游的Caspase-3效應(yīng)子，最終使肉達(dá)到嫩化。2）內(nèi)在途徑，當(dāng)在缺氧和甲磺雙氫麥角胺應(yīng)激的條件下Caspase-9啟動子受到活化，隨后激活下游Caspase-3效應(yīng)子，使肉被嫩化，這與Earnshaw等［31］研究的相近。3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)途徑，也叫ER介導(dǎo)路徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有特異性蛋白酶Caspase-12，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到外界刺激時，被激活的Caspase-12能直接激活Caspase-9，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與肉嫩化過程［33-35］。

Kemp等［36］證實(shí)了Caspase在體外能模擬畜禽動物體內(nèi)原位置蛋白酶分解肌原纖維蛋白，促使宰后肌原纖維的分解作用的增加，通過分析鑒定這些蛋白水解物，發(fā)現(xiàn)分別為肌動蛋白、肌鈣蛋白-T和肌球蛋白輕鏈。當(dāng)用Caspase-3的人工合成抑制劑（Ac-DEVD-CHO）與Caspase家族一起體外培養(yǎng)肌原纖維蛋白時，則觀察不到結(jié)蛋白和肌鈣蛋白-T的明顯降解作用，說明Caspase參與宰后肉嫩度變化。隨后在宰后早期用Caspase-3抑制劑培養(yǎng)calpastatin時，抑制calpastatin本身分解，表明Caspase-3促進(jìn)了calpastatin分解，也可以在某種程度上說明在宰后早期calpastatin分解的越多，Caspase激活程度越大［37］。因此，如果Caspase家族酶在畜禽宰后成熟期有活性，則可以通過將calpastatin水解來影響肉的嫩度，同時可能增加calpain的活性，從而提高肉的嫩度。

5　結(jié) 語

Sentandreu等［5］認(rèn)為畜禽肉最終嫩度是由宰后蛋白質(zhì)的變化程度和肌纖維斷裂程度所決定，已有很多研究證實(shí)calpain酶系統(tǒng)參與宰后蛋白質(zhì)水解過程。同時有不少研究表明calpastatin在肉嫩化過程中起到了重要的作用。并且畜禽物種之間以及宰后肌肉不同處理之間，參與宰后嫩化過程的主要貢獻(xiàn)酶可能有所不同。根據(jù)前人研究牛、羊、小鼠物種間的蛋白酶體活性研究發(fā)現(xiàn)，不同物種間存在著蛋白酶體活性差異。另外，本研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了畜禽動物宰后成熟過程肌肉不同處理，發(fā)現(xiàn)calpain以及Caspase之間存在著很大的差異，相關(guān)機(jī)理有待于進(jìn)一步研究和發(fā)表成果。因此，對于畜禽動物相關(guān)的蛋白酶，除了從這些相關(guān)酶的內(nèi)部生理生化性狀考慮是否可以參與宰后肌肉嫩化過程之外，還可以從改變外部條件是否可以進(jìn)一步促進(jìn)宰后肌肉的嫩化過程這一方面考慮。

在考慮蛋白酶體參與宰后肉嫩化過程同時，考慮從畜禽物種以及體積方面做深入的研究，像Caspase系統(tǒng)這樣的其他特異性蛋白水解體系，可以從內(nèi)部本身溶酶體破裂的條件、底物的分解程度、以及Caspase與calpain、calpastatin之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

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Advances in Research on Endogenous Proteolytic Enzymes for Postmortem Tenderization of Livestock and Poultry Meat

LI Jingjing， ZHANG Ruihong， HAN Dongxue， YU Longhao*
（College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

The mechanism of postmortem tenderization of muscle has been controversial for years. It is generally accepted that the improvement of meat tenderness mainly results from five endogenous proteolytic enzymes， including lysosomal cathepsin， proteasome， calpain， calpastatin and caspase. Calpains were widely considered to be a major contributor； however the latest studies reveal the role of caspases in muscle tenderness. The molecular weights， distribution， substrates， action sites， activation conditions， optimum pH and inhibitors of five enzymes involved in meat tenderization are briefly reviewed in this paper. The possible activation pathways and transformation ways of the enzymes are also discussed with the aim of providing a guideline for the application of these proteolytic enzymes to improve meat tenderness.

postmortem tenderizatio n； protease； physiological and biochemical properties

R337.1

A

1002-6630（2015）15-0240-05

10.7506/spkx1002-6630-201515044

2014-11-11

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171712）

李晶晶（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與技術(shù)。E-mail：591388563@qq.com

俞龍浩（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與技術(shù)。E-mail：yu2058@sohu.com