尿道外口皮下注射透明質(zhì)酸建立大鼠膀胱出口梗阻模型及效果評(píng)價(jià)

王永權(quán)，熊智勇，龔 薇，方 強(qiáng)，周占松，盧根生

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科，重慶 400038)

·基礎(chǔ)研究·

尿道外口皮下注射透明質(zhì)酸建立大鼠膀胱出口梗阻模型及效果評(píng)價(jià)

王永權(quán)，熊智勇，龔 薇，方 強(qiáng)，周占松，盧根生

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科，重慶 400038)

目的 通過尿道外口皮下注射透明質(zhì)酸的方法建立一種簡(jiǎn)單微創(chuàng)、重復(fù)性好的大鼠膀胱出口梗阻(BOO)動(dòng)物模型，并與傳統(tǒng)開放手術(shù)BOO動(dòng)物模型進(jìn)行比較，評(píng)估其梗阻效果及并發(fā)癥情況。方法 共40只成年雌性SD大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分為3組，即尿道外口透明質(zhì)酸注射組(簡(jiǎn)稱注射組)、開放手術(shù)近端尿道結(jié)扎組(簡(jiǎn)稱手術(shù)組)和對(duì)照組。注射組(n=15)采用0.2 mL透明質(zhì)酸在尿道外口皮下周圍注射的方法建立模型；手術(shù)組(n=15)利用傳統(tǒng)開放性近端尿道結(jié)扎的方法建立模型；另10只正常大鼠作為對(duì)照。4周后檢測(cè)各組充盈性膀胱測(cè)壓檢測(cè)梗阻效果、術(shù)后并發(fā)癥、膀胱重量、以及HE染色檢測(cè)膀胱組織學(xué)改變。結(jié)果 注射組較手術(shù)組的模型操作時(shí)間顯著縮短(P<0.05)，無切口感染和膀胱結(jié)石等并發(fā)癥；充盈性膀胱測(cè)壓結(jié)果提示：與對(duì)照組相比，注射組和手術(shù)組均檢測(cè)到膀胱容量、排尿頻率和殘余尿量增加及儲(chǔ)尿末期逼尿肌不穩(wěn)定收縮的典型膀胱出口梗阻的尿動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)；注射組和手術(shù)組膀胱重量明顯增加(P<0.05)，HE染色可見梗阻后膀胱黏膜下及間質(zhì)明顯水腫、肌層厚度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 大鼠尿道外口透明質(zhì)酸注射簡(jiǎn)單微創(chuàng)、并發(fā)癥少、效果明確、可重復(fù)性好，是一種有效的膀胱出口梗阻動(dòng)物模型。

透明質(zhì)酸；膀胱出口梗阻；動(dòng)物模型

膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction，BOO)常見于良性前列腺增生、女性膀胱頸梗阻、尿道狹窄、神經(jīng)源性膀胱等儲(chǔ)/排尿功能障礙性疾病，引起一系列下尿路相關(guān)并發(fā)癥[1]。臨床上對(duì)其病理生理學(xué)機(jī)制尚缺乏充分認(rèn)識(shí)，因此，深入了解和探索膀胱出口梗阻后儲(chǔ)/排尿功能的病理生理學(xué)變化，有重要的臨床意義。

研究疾病的發(fā)病機(jī)制和病理生理變化常常需要依靠建立理想的動(dòng)物模型，一個(gè)好的疾病模型應(yīng)具有再現(xiàn)性好、復(fù)制率高、專一性好等特點(diǎn)[2]。大量關(guān)于BOO的研究中都涉及動(dòng)物模型的構(gòu)建，其原理是利用手術(shù)的方法模擬膀胱流出道梗阻[3]。目前研究BOO的動(dòng)物模型主要采用開放手術(shù)行近端尿道部分結(jié)扎或者在膀胱頸植入束縛環(huán)的方法[4-6]，這些方法雖然可以有效模擬BOO狀態(tài)，但是存在手術(shù)操作時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)、創(chuàng)傷較大、結(jié)扎松緊程度不易控制、異物排斥反應(yīng)、術(shù)后感染、膀胱結(jié)石等并發(fā)癥發(fā)生率較高等缺點(diǎn)。膨脹劑在泌尿外科領(lǐng)域通過增加尿道阻力的原理常常被應(yīng)用于治療尿失禁[7]，因此，理論上通過相同的原理可以建立BOO動(dòng)物模型。因此針對(duì)傳統(tǒng)模型的一些不足和缺陷，應(yīng)用膨脹劑局部注射的原理，本研究通過透明質(zhì)酸尿道口周圍皮下注射的方法建立一種新的大鼠膀胱出口梗阻模型，并與傳統(tǒng)手術(shù)結(jié)扎的方法在手術(shù)時(shí)間、術(shù)后并發(fā)癥及梗阻效果等方面進(jìn)行比較，為更好研究BOO后的儲(chǔ)/排尿功能障礙提供一種良好的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型準(zhǔn)備總共40只 Sprague-Dawley雌性大鼠(體重220～260 g，第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)進(jìn)行研究。手術(shù)操作前，所有的動(dòng)物均用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射進(jìn)行麻醉。尿道口周圍透明質(zhì)酸注射組(注射組，n=15)通過尿道外口周圍皮下5、7、12點(diǎn)方位分別注射0.2 mL透明質(zhì)酸鈉(瑞典Q-Med公司)制作膀胱出口梗阻模型(圖1A)。開放手術(shù)尿道結(jié)扎組(手術(shù)組，n=15)按照KIM等人[8]的方法進(jìn)行手術(shù)操作：將直徑為1 mm的硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道外口插入膀胱，以此作為尿道支撐。取下腹部正中切口，長(zhǎng)約1.5～2 cm，逐層切開皮膚及皮下組織，分離腹壁肌肉，打開腹膜，仔細(xì)游離膀胱-尿道交界處，近端尿道稍作分離，于此處穿過3-0絲線，結(jié)扎近端尿道，然后拔除尿道內(nèi)導(dǎo)管，逐層縫合關(guān)閉切口(圖1B)。另取10只正常大鼠作為對(duì)照組。4周后，觀察模型動(dòng)物存活情況、并發(fā)癥情況、充盈性膀胱測(cè)壓檢測(cè)梗阻效果及膀胱組織學(xué)檢測(cè)。

1.2 充盈性膀胱測(cè)壓根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法行充盈性膀胱測(cè)壓檢測(cè)：麻醉同前，大鼠取仰臥位，四肢體固定，酒精消毒尿道外口及會(huì)陰部，將外直徑為0.5 mm的聚乙烯導(dǎo)管，經(jīng)尿道外口插入膀胱；輕壓豚鼠腹部，排盡尿液，導(dǎo)管經(jīng)三通管與尿動(dòng)力檢測(cè)儀及微量灌注泵相連；用微量灌注泵以0.2 mL/min速率灌注，膀胱灌注液采用生理鹽水，同步記錄隨容積增加膀胱壓力波形、最大膀胱容量(maximum cystometric capacity，MCC)、最大排尿壓力(maximal micturition pressure，Pmax)、排尿頻率(Frequency)、充盈期膀胱不穩(wěn)定收縮波(non-voiding detrusor contractions，NVCs)以及膀胱殘余尿(postvoiding residual volume，PRV)等。

圖1 尿道外口透明質(zhì)酸注射及開放性近端尿道結(jié)扎建立BOO模型示意圖

1.3 組織學(xué)觀察建模后4周，各組動(dòng)物斷頸處死，開腹取出膀胱并稱重，計(jì)算膀胱重量(mg)和體重(g)之比。所有膀胱標(biāo)本都用10%甲醛(體積分?jǐn)?shù))固定。石蠟組織包埋后以5 μm厚度切片。切片用蘇木精-伊紅染色(HE)在光學(xué)顯微鏡下觀察膀胱組織學(xué)改變，同時(shí)測(cè)量各組膀胱體部黏膜和漿膜層之間的平滑肌層厚度進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

注射組平均手術(shù)時(shí)間(3.5±0.3)min，顯著短于手術(shù)組操作時(shí)間(15.6±5.4)min(P<0.01)。對(duì)照組和注射組大鼠均存活至術(shù)后4周。注射組大鼠無一只出現(xiàn)感染、膀胱結(jié)石等并發(fā)癥；手術(shù)組大鼠中，共有2只發(fā)生手術(shù)切口感染，其中1只死于嚴(yán)重感染。2只大鼠由于尿道結(jié)扎過緊并發(fā)膀胱結(jié)石。3組大鼠并發(fā)癥情況比較詳見表1。所有出現(xiàn)并發(fā)癥的動(dòng)物被排除進(jìn)入充盈性膀胱測(cè)壓和組織學(xué)觀察。

表1 注射組、手術(shù)組和對(duì)照組術(shù)后并發(fā)癥情況(例)

組 別n動(dòng)物死亡切口感染膀胱結(jié)石注射組15000手術(shù)組15122對(duì)照組10000

充盈性膀胱測(cè)壓結(jié)果顯示注射組和手術(shù)組大鼠均出現(xiàn)非常典型的膀胱出口梗阻尿動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)， Pmax、排尿頻率、MCC、PRV與對(duì)照組相比明顯增加(P<0.01，表2)；在儲(chǔ)尿期均可觀察到高于10 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)的NVCs(圖2)。雖然上述指標(biāo)注射組和手術(shù)組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但值得注意的是，注射組各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差均小于手術(shù)組，進(jìn)一步顯示注射組模型的一致性和可重復(fù)性較好。

表2 注射組、手術(shù)組和對(duì)照組術(shù)后4周行充盈性膀胱測(cè)壓結(jié)果

組 別n最大膀胱容量(mL)最大排尿壓力(cmH2O)排尿間隔(s)殘余尿(mL)注射組151.66±0.17*39.47±3.13*152.13±20.13*0.26±0.10*手術(shù)組151.81±0.59*42.11±7.99*165.23±56.30*0.28±0.13*對(duì)照組101.38±0.13 31.28±3.37 256.2±25.550

與對(duì)照組相比，*P<0.05。

建模后4周后稱重結(jié)果顯示注射組(206.1±17.3) g、手術(shù)組(210.2±14.6) g、與對(duì)照組[(209.2±16.2) g]沒有顯著差異；但建模后膀胱重量(mg)/體重(g)比率結(jié)果表明：手術(shù)組(1.41±0.37)和注射組(1.26±0.13)與對(duì)照組(0.47±0.03)相比顯著提高(P<0.01)，提示BOO后出現(xiàn)膀胱的代償性肥厚和增生。HE染色鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)注射組膀胱平滑肌層厚度 (805±77) μm和手術(shù)組厚度(961±186) μm顯著高于對(duì)照組[(442±39)μm，P<0.01]；還觀察到注射組和手術(shù)組黏膜下層和間質(zhì)充血水腫以及膀胱平滑肌肥大等組織病理學(xué)特征(圖3)，為BOO典型的膀胱組織結(jié)構(gòu)變化[10]。

圖2 注射組、手術(shù)組和對(duì)照組術(shù)后4周行充盈性膀胱測(cè)壓圖

圖3 注射組、手術(shù)組和對(duì)照組術(shù)后4周膀胱組織(HE，×40)

3 討 論

盡管細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究方法高速發(fā)展，然而為了觀察和檢測(cè)機(jī)體的協(xié)調(diào)活動(dòng)和整體狀態(tài)，使用動(dòng)物模型模擬病理狀態(tài)的方法仍然是必不可少的[11]。最早出現(xiàn)的大鼠BOO的模型是1988年STEER等人[12]用尿道結(jié)扎的方法建立，在結(jié)扎后6周觀察大鼠膀胱容量、重量、排尿頻率以及排尿反射等病理生理學(xué)變化，并沿用至今。隨后的幾年中，一些學(xué)者又采用了膀胱頸或后尿道植入物的方法將硅膠或金屬環(huán)、氣囊等通過手術(shù)的方法置入大鼠體內(nèi)[5, 13-14]，也能獲得同結(jié)扎類似的效果，并且利用異物產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，局部纖維瘢痕不斷增加的原理可模擬慢性梗阻加重的變化過程。然而上述模型的制作方法均是通過外科手術(shù)的方式，創(chuàng)傷較大，術(shù)后感染或膀胱結(jié)石等并發(fā)癥常難以避免，絲線結(jié)扎尿道的方法也較難保證每只動(dòng)物的結(jié)扎松緊度一致，如結(jié)扎過緊可能導(dǎo)致嚴(yán)重腎積水、泌尿系結(jié)石等導(dǎo)致動(dòng)物死亡的風(fēng)險(xiǎn)[15]；而外源性置入物可能產(chǎn)生的異物排斥反應(yīng)也部分限制了其應(yīng)用范圍，因此到目前為止，沒有一種BOO大鼠模型是完美的。

膨脹劑的應(yīng)用最早出現(xiàn)在整形外科領(lǐng)域，利用組織相容性良好的填充物對(duì)局部的組織缺陷進(jìn)行修復(fù)，以達(dá)到治療或美容的目的[16-17]。而在泌尿外科領(lǐng)域最早應(yīng)用于治療尿失禁(如聚四氟乙烯等材料)[18]，但是有報(bào)道一些患者注射后可出現(xiàn)下尿路梗阻的并發(fā)癥[19]，因此并沒有得到廣泛應(yīng)用，但提供了新的思路，CANNING等人[20]首先報(bào)道了在兔的尿道周圍注射自體脂肪制作BOO模型，可模擬尿頻、膀胱重量增加和對(duì)膽堿類藥物反應(yīng)更敏感等改變，但是自體脂肪組織存在吸收和感染的風(fēng)險(xiǎn)較大。透明質(zhì)酸(或玻尿酸)是一種酸性黏多糖，存在于組織間、關(guān)節(jié)頭的滑液中和眼球內(nèi)的玻璃質(zhì)中，起到黏合、潤滑和保護(hù)的作用。醫(yī)用的玻尿酸常常是整形外科領(lǐng)域的良好填充劑，可用于除皺、隆鼻等領(lǐng)域，在泌尿外科中也有報(bào)道應(yīng)用于治療小兒先天性膀胱輸尿管返流[21]。透明質(zhì)酸的優(yōu)點(diǎn)在于良好的組織相容性、很難被機(jī)體吸收、方便注射等[22]，因此對(duì)于研究膀胱出口慢性梗阻提供了一種良好的材料，我們的研究結(jié)果表明：透明質(zhì)酸尿道口局部注射簡(jiǎn)便易行，無需開放手術(shù)，操作時(shí)間明顯短于開放手術(shù)結(jié)扎，術(shù)后無明顯并發(fā)癥，動(dòng)物存活率100%。尿動(dòng)力學(xué)的結(jié)果也提示注射透明質(zhì)酸的方法可達(dá)到和開放手術(shù)結(jié)扎相同的膀胱出口梗阻效果，在膀胱排尿壓力、排尿頻率、不穩(wěn)定收縮和殘余尿等指標(biāo)上均表現(xiàn)為典型的BOO表現(xiàn)，而且注射組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差都小于手術(shù)組，提示其可重復(fù)性和穩(wěn)定性優(yōu)于手術(shù)組。組織學(xué)的觀察也發(fā)現(xiàn)了典型的逼尿肌肥大、肌層增厚和間質(zhì)充血水腫的梗阻后膀胱病理學(xué)改變。這些結(jié)果都提示了大鼠尿道周圍注射是一種簡(jiǎn)單有效、相關(guān)并發(fā)癥少、安全微創(chuàng)、可重復(fù)性好的BOO動(dòng)物模型，是研究膀胱功能障礙的一種良好工具。

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(編輯 王 瑋)

Urethralorifice hyaluronic acid injections: a novel animal model of bladder outlet obstruction

WANG Yong-quan, XIONG Zhi-yong, GONG Wei, FANG Qiang, ZHOU Zhan-song,LU Gen-sheng

(Department of Urology, Southwestern Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

Objective To reduce surgery trauma and achieve the effect of bladder outlet obstruction (BOO), we explored a novel animal model by hyaluronic acid periurethral injection and compared the obstructive effects and complications of this model with traditional open partial proximal urethral obstruction surgery.Methods A total of 40 Sprague-Dawley female rats were divided into 3 groups: 15 rats were subcutaneously injected with 0.2 mL hyaluronic acid at 5,7,12 o’clock of urethral orifice respectively, another 15 rats undertook traditional open partial proximal urethral obstruction surgery, and 10 normal rats were set as control. After 4 weeks, the bladder weight, complications, filling cystometric study and histopathological features were evaluated by hematoxylin and eosin (HE) staining in each group. Results Hyaluronic acid periurethral injection caused increased maximum cystometric capacity, maximum bladder pressure, micturation interval, and postvoid residual urine volume compared with control (P<0.01). Moreover, the injection group had significantly shorter operative time, less incidence of incision infection compared to the surgery group (P<0.01). HE staining showed suburothelial and interstitial hyperemia edema and smooth muscle hypertrophy in both injection and surgery bladders, which could not been found in control group. There was a significant increase in the bladder weight and thickness of smooth muscle in the bladders of injection group and surgery group compared with control group (P<0.01). Conclusions Hyaluronic acid periurethral injection provided a simple and effective model of BOO with fewer complications and simpler process compared with traditional surgery model. It seems to be a useful research tool for understanding the pathophysiological change of BOO.

hyaluronic acid;bladder outlet obstruction; animal model

2014-06-24

2014-09-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81000288 81270845)

盧根生，教授. E-mail：lugeng8@hotmail.com

王永權(quán)(1980-),男(漢族)，博士，主治醫(yī)師，講師.研究方向：排尿功能障礙和尿動(dòng)力學(xué).E-mail: wangyongquan@aliyun.com

R694

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-01-013