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    促進(jìn)微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究

    2015-04-06 23:53:00李凌彥趙汝麗魏云林林連兵季秀玲
    關(guān)鍵詞:孢霉產(chǎn)油脫氫酶

    張 琦, 李凌彥, 趙汝麗, 魏云林, 林連兵, 季秀玲

    (昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500)

    促進(jìn)微生物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的研究

    張 琦, 李凌彥, 趙汝麗, 魏云林, 林連兵, 季秀玲

    (昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500)

    多不飽和脂肪酸 (PUFAs)作為功能性油脂已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。隨著對純PUFAs脂質(zhì)的需求量越來越多,來自于動植物和深海洋魚的PUFAs遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求,且動植物含油量及不飽和脂肪酸類型、比例均受到一定的限制。一系列的研究表明,微生物特別是藻類、真菌能合成幾乎所有的PUFAs,并能在工業(yè)規(guī)模上培育有開發(fā)價值的可替代生物資源。作者在近年來國內(nèi)外有關(guān)研究的基礎(chǔ)上,從培養(yǎng)條件、菌種選育、基因工程、代謝調(diào)控等方面對促進(jìn)微生物產(chǎn)PUFAs的研究進(jìn)行了綜述,為相關(guān)的研究提供參考。

    微生物;多不飽和脂肪酸;生物合成

    多不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長18~22個碳原子的直鏈脂肪酸。PUFAs根據(jù)結(jié)構(gòu)分為兩大類:一類是n-3PUFAs,主要包括α-亞麻酸(α-Linolenic acid,ALA,C18∶3 n-3)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA,C20∶5n-3)和二十二碳六烯酸 (Docosahexaenoic acid,DHA,C22∶6n-3);另一類是n-6PUFAs,主要包括亞油酸(Linoleic acid,LA,C18∶2n-6)、γ-亞麻酸 (γ-Linolenic acid,GLA,C18∶3 n-6)和花生四烯酸 (Arachidonic acid,AA,C20∶4 n-3)等[1]。PUFAs的合成是以飽和脂肪酸(如硬脂酸)作為底物,通過一系列脫氫酶(desaturase)和延長酶(elongase)的催化作用形成。因PUFAs獨(dú)特的生物活性,其在生物制藥和營養(yǎng)保健品及化妝品領(lǐng)域中廣泛受到關(guān)注和應(yīng)用[2-3]。研究表明,PUFAs對機(jī)體的激素代謝和酶活起著調(diào)控功能,是維持正常生命活動所必需的,而且對人類很多疾病具有明顯預(yù)防和治療作用,一旦缺乏會引起機(jī)體生理失調(diào)而導(dǎo)致多種疾病,臨床已將PUFAs應(yīng)用于心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、癌癥、神經(jīng)發(fā)育及糖尿病等多種疾病的冶療[3-4]。

    過去人們以植物、一些哺乳動物及海洋魚油為資源,采取壓榨法和化學(xué)溶劑法生產(chǎn)PUFAs的產(chǎn)品純度低、產(chǎn)量少、污染環(huán)境、有害物殘留多以及易變質(zhì)[2]。由于PUFAs獨(dú)特的功效,其需求量越來越多,現(xiàn)有的資源和生產(chǎn)方式遠(yuǎn)不能滿足市場需求。為此,尋求替代的生物資源以及規(guī)?;?、合理化的生產(chǎn)途徑已成為研發(fā)人員的熱門課題。PUFAs存在于動物和植物中,但在微生物特別在一些藻類、真菌和細(xì)菌中含量豐富,多以貯存油和膜脂的形式存在。近年來,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,已獲得更多具有產(chǎn)油能力高或其油脂組成中富含稀有脂肪酸的產(chǎn)油微生物資源,提高了微生物的產(chǎn)油率。近來美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)的報告特別指出,微生物油脂發(fā)酵可能是生物柴油生產(chǎn)和生物經(jīng)濟(jì)的重要研究方向[5],而且在德國、美國和日本等國均有商品菌油面市。開發(fā)微生物PUFAs可以部分或完全取代動植物中的PUFAs,有廣闊的市場前景。迄今,國內(nèi)外有關(guān)微生物生產(chǎn)PUFAs方面已有大量的研究報道,作者就促進(jìn)微生物產(chǎn)PUFAs的優(yōu)化方法進(jìn)行總結(jié)。

    1 優(yōu)化培養(yǎng)條件提高微生物產(chǎn)PUFAs

    微生物合成PUFAs和培養(yǎng)條件相關(guān)。培養(yǎng)條件變化,微生物的生理形態(tài)及細(xì)胞的生化等發(fā)生改變,從而影響菌體的產(chǎn)量及PUFAs的組成和產(chǎn)率。許多研究表明,營養(yǎng)源、溫度、通氣量、光照、金屬離子、pH、鹽度及NaCl等培養(yǎng)條件的變化可以明顯影響微生物體內(nèi)PUFAs的合成和積累[3,6-7]。Peng等[8]通過在高山被孢霉(Mortierella alpina)ME-1發(fā)酵培養(yǎng)基中添加正十六烷,使AA含量提高28.9%。De Oliveira Carvalho等[9]研究發(fā)現(xiàn),低溫促進(jìn)PUFAs的累積,將毛霉菌 (Mucor sp.)LB-54的培養(yǎng)溫度從28℃降為 12℃時,GLA的含量從 15%增加到24%,作者所在實(shí)驗(yàn)室通過對部分產(chǎn)油真菌的研究也獲得類似結(jié)果。溫少紅等[10]研究表明,高光強(qiáng)培養(yǎng)的紫球藻細(xì)胞中類脂的含量是低光強(qiáng)培養(yǎng)下的2.1倍,在弱光下有利于AA的合成,中等光強(qiáng)則對EPA的積累有利。Muhid等[11]研究發(fā)現(xiàn),Mg2+、Fe3+、Zn2+對小克銀漢霉(Cunninghamella sp.)2A1油脂的積累影響較大,其中Zn2+較對照組GLA的含量增加了74%。利用環(huán)境條件變化對細(xì)胞內(nèi)能荷、還原力和對油脂積累的影響指導(dǎo)發(fā)酵,優(yōu)化發(fā)酵工藝,從而使代謝流向所需產(chǎn)物,進(jìn)一步提高PUFAs產(chǎn)量。

    2 誘變技術(shù)在微生物高產(chǎn)PUFAs上的應(yīng)用

    近年來國內(nèi)外研究人員一直在探索利用誘變育種等技術(shù)對野生產(chǎn)PUFAs菌株進(jìn)行改造,進(jìn)一步提高PUFAs的含量。呂颯音等[12]用紫外線誘變,以甘草酸進(jìn)行篩選,獲得了高產(chǎn)菌被孢霉A20,其生物量較出發(fā)菌株提高了25.5%,GLA產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了81%。馮云等[13]利用亞硝基胍(NTG)和紫外照 射 對 裂 殖 壺 菌 (Schizochytrium sp.)CCTCC M209059)進(jìn)行復(fù)合誘變,突變株Schizochytrium sp. HX-308M中產(chǎn)乙酰輔酶A和NADPH的酶活力提高,細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A和NADPH含量顯著增加,DHA含量比野生型菌株提高了38.88%。李忠玲等[14]利用紫外線誘變結(jié)合失水蘋果酰肼篩選的方法,獲得一株少根根霉突變株,其GLA含量最高提高了276.5%。李麗娜等[15]采用微波誘變并結(jié)合乙酰水楊酸進(jìn)行誘變篩選,獲得一株深黃被孢霉突變株,其AA產(chǎn)量比原始對照菌株提高3.18倍。利用誘變育種技術(shù)可以得到多種優(yōu)良突變體和新的有益基因類型,但是誘變育種也存在一定的盲目性和隨機(jī)性,是一個相當(dāng)繁瑣的過程,在實(shí)際應(yīng)用中,根據(jù)出發(fā)菌株及實(shí)驗(yàn)室條件等具體情況來選擇合適的誘變方法,發(fā)展一種簡單易行的篩選方法。

    3 PUFAs合成相關(guān)酶的基因工程應(yīng)用

    微生物發(fā)酵生產(chǎn)PUFAs的缺點(diǎn)是對高產(chǎn)菌株的選育困難,而且菌種發(fā)酵周期長、產(chǎn)率低。通過基因工程手段增加編碼PUFAs合成相關(guān)酶基因的拷貝數(shù)來提高微生物生產(chǎn)酶的數(shù)量,以提高微生物合成PUFAs的能力。目前,研究人員已成功構(gòu)建多種過表達(dá)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),為日后基因工程育種方面的研究奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。Sakuradani等[16]將alpine高山被孢霉IS-4Δ12-脂肪酸脫氫酶基因在高山被孢霉Δ12-脂肪酸脫氫酶缺陷型突變株JT-180中過表達(dá),AA產(chǎn)量比原始菌株提高66.7%。Takeno等[17]將高山被孢霉IS-4中GLELO基因 (編碼脂肪酸延長酶EL2)連接在pDura5載體上導(dǎo)入菌株高山被孢霉IS-4中過表達(dá),轉(zhuǎn)基因菌株中AA產(chǎn)量比原始菌株提高了近一倍。

    除了過表達(dá)PUFAs合成相關(guān)基因外,也可通過基因工程手段將PUFAs合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)化微生物,改良后者的油脂組成,產(chǎn)生特殊的PUFAs。李明春等[18]將高山被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母進(jìn)行表達(dá),基因工程菌酵母中GLA含量占總脂肪酸的16.26%。Chuang等[19]通過將高山被孢霉的Δ6-和Δ12-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表達(dá),轉(zhuǎn)基因菌株中產(chǎn)生了新的PUFAs-GLA,占總脂肪酸的20%。劉建民等[20]將高山被孢霉W15菌株的Δ5-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,分析表明,Δ5-脂肪酸脫氫酶可催化底物脫氫生成AA。最近,作者所在研究室也將高山被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)油酵母——紅冬孢酵母中進(jìn)行表達(dá),也獲得產(chǎn)GLA的紅冬孢酵母基因工程菌株[21]。脫氫酶基因的過表達(dá)對微生物合成PUFAs有重要的影響?;谖⑸锘蛩缴系纳钊胙芯浚苿恿搜芯咳藛T對于PUFAs合成的代謝機(jī)理方面的認(rèn)識。

    4 脂肪酸合成途徑中關(guān)鍵酶對微生物產(chǎn)PUFAs的影響

    細(xì)胞中PUFAs的合成不僅與脂肪酸脫氫酶系有關(guān),還與脂肪酸合成代謝過程的關(guān)鍵酶密切相關(guān)。對PUFAs生物合成代謝途徑及關(guān)鍵酶的研究是開展基因工程育種研究的必要前提。脂肪酸合成起始于乙酰-CoA,檸檬酸裂解酶 (ATP-citrate lyase,ACL)、乙酰輔酶A羧化酶 (acetyl-CoA carboxylase,ACC)和蘋果酸酶 (malic enzyme,ME)是啟動脂肪酸合成的3個關(guān)鍵酶,為脂肪酸合成前體物質(zhì)乙酰-CoA和還原力NADPH,促進(jìn)油脂累積[2,22]。許多研究表明,調(diào)節(jié)這三個酶的活性和表達(dá)水平有助于PUFAs的合成[23]。Ren等[24]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蘋果酸使 Schizochytrium sp.HX-308產(chǎn)油量提高了15%,而且總脂肪酸中DHA含量從35%提高到60%。魏萍等[25]通過向培養(yǎng)基中添加檸檬酸使裂殖壺菌HX-308(CCTCC M209059)DHA產(chǎn)量高達(dá)12.2 g/L,比對照提高了35.41%。Zhang等[26]將卷枝毛霉(Mucor circinelloides)CBS108.16和高山被孢霉菌株P(guān)eyron CBS696.70的蘋果酸酶基因分別導(dǎo)入亮氨酸缺陷型卷枝毛霉R7B中過表達(dá),結(jié)果顯示GLA的含量從 23.2%分別提高到了 26.1%和30.1%。Ruenwai等[27]從魯氏毛霉(Mucor rouxii)中克隆獲得ACC1基因,導(dǎo)入到非油脂酵母Hansenula polymopha中過表達(dá),脂肪酸含量提高了40%。有研究者通過過表達(dá)蘋果酸酶基因發(fā)現(xiàn),宿主菌內(nèi)PUFAs含量并無變化,這可能與不同的生物環(huán)境中蘋果酸酶基因存在不同的酶活性質(zhì)有關(guān),類似的報道還有待進(jìn)一步深入研究。

    5 展望

    近年來許多研究表明,細(xì)菌、真菌等微生物通過細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的信息交流來協(xié)調(diào)群體,影響一系列生理生化特征。趙宗保等[28]分析了真菌群體感應(yīng)分子色醇對L.starkeyi產(chǎn)油能力的影響。結(jié)果表明,在培養(yǎng)基添加色醇,L.starkeyi的生物量、產(chǎn)油脂量和油脂得率系數(shù)都明顯增加,還縮短發(fā)酵時間。日本學(xué)者Kimura等[29]通過對多種香料成分對L.starkeyi產(chǎn)油能力的影響研究表明,茴香腦、松油醇、乙酰苯等能使產(chǎn)油微生物油脂積累提高10%~46%。雖然已發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)分子有助于提高產(chǎn)油率,但目前沒有特異性提高某種PUFAs含量的研究報道,不過這些工作仍為進(jìn)一步研究群體感應(yīng)促進(jìn)微生物產(chǎn)PUFAs提供了依據(jù)。

    隨著對PUFAs生理及藥用價值的深入研究,其需求量大幅增加,因此提高PUFAs產(chǎn)量也逐步成為研究熱點(diǎn)。目前的研究主要集中于培養(yǎng)條件的優(yōu)化,這在一定程度上能提高PUFAs的產(chǎn)量,但總體上并不明顯,這主要是由于微生物產(chǎn)PUFAs的生物合成過程極為復(fù)雜,從葡萄糖至PUFAs的合成涉及20多步酶促反應(yīng),難以確定合成PUFAs的關(guān)鍵步驟,也不清楚微生物群體感應(yīng)的相互調(diào)節(jié)機(jī)制,還存在著葡萄糖轉(zhuǎn)化率低、生長周期長和發(fā)酵過程難以控制等問題。隨著現(xiàn)代生物學(xué)研究的發(fā)展,利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等研究來了解PUFAs合成的調(diào)節(jié)機(jī)制,同時結(jié)合基因工程和代謝調(diào)控技術(shù)來提高微生物PUFAs產(chǎn)量,將成為今后的主要研究方向之一。

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    Research Progress on the Enhancement of the Production of Polyunsaturated Fatty Acids in Microorganisms

    ZHANG Qi, LI Lingyan,ZHAO Ruli,WEI Yunlin,LIN Lianbing,JI Xiuling
    (College of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

    Polyunsaturated fatty acids(PUFAs),as functional oil components,have been widely used in food industry.The PUFAs produced from plants,mammals and deep-sea fish is inadequate for supplying the expanding market demands,and the content of vegetable and animal oils,types and proportion of unsaturated fatty acids in these oils also show limitations for further application. Microorganisms,especially algae and fungi,have been recognized as promising sources that can synthesize the entire range of PUFAs,and can be used as valuable alternative sources for PUFAs production on an industrial scale.This paper reviews the progress in the research of enhancement of polyunsaturated fatty acid production,based on the related research in culture condition,strain screening,gene engineering and metabolic regulation,providing theoretical and applicable references for relative domestic and international research.

    microorganisms,polyunsaturated fatty acids,biosynthesis

    Q547

    A

    1673—1689(2015)08—0785—05

    2014-12-29

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160016;31260034);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目(KKSA201126005);教育部回國人員科研啟動基金項(xiàng)目(KKQA201226003)。

    張 琦(1975—),男,云南大理人,理學(xué)博士,教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事微生物分子生物學(xué)與生物化學(xué)方面的研究。

    E-mail:qzhang37@hotmail.com

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