超聲波輔助復(fù)合酶提取菊糖工藝優(yōu)化

范三紅，李 靜，王亞云，胡雅喃

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

超聲波輔助復(fù)合酶提取菊糖工藝優(yōu)化

范三紅，李 靜，王亞云，胡雅喃

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

以菊芋塊莖為原料，采用超聲波輔助復(fù)合酶酶解法進(jìn)行菊糖提取工藝研究。首先通過(guò)單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman篩選試驗(yàn)確定菊糖提取工藝中影響顯著的3 個(gè)因素——超聲溫度、超聲時(shí)間和加酶量，再利用Box-Behnken試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法優(yōu)化最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度51 ℃、加酶量120 ?g/g（m（果膠酶）∶m（纖維素酶）=1∶4）、超聲時(shí)間25 min、pH 5.5，優(yōu)化后菊糖得率為72.2%。

超聲波；復(fù)合酶；菊糖；響應(yīng)面

菊芋（Helianthus tuberosus L.）俗名洋姜、鬼子姜，屬多年生菊科向日葵屬，為食用地下塊莖的薯芋類(lèi)蔬菜[1]。菊糖在菊芋中占有很大比例，它是一種聚合度2～60的混合物[2]。菊糖有很多功能性作用，如預(yù)防糖尿病人的低血糖以及促進(jìn)腸道雙歧桿菌的生長(zhǎng)，因此可以作為糖、脂肪替代物[3]而大量用于低熱量、低糖、低脂肪食品中，并能顯著改善無(wú)脂或低脂食品的口感[4]和質(zhì)感,不僅如此，菊糖還具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收[5]和制備低聚果糖、超高純度果糖漿[6-7]等功能。研究[8-9]表明，每日攝食2 g菊糖對(duì)控制人體的質(zhì)量、改善腸道功能、防止機(jī)體失調(diào)以及老年性疾病很有幫助。因此，菊糖已被世界上40多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)為食品的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑。

目前，菊糖的提取主要采用熱水浸提法，該方法提取菊糖不僅提取率很低，而且耗時(shí)長(zhǎng)，并且長(zhǎng)時(shí)間的高溫加熱容易破壞菊芋中其他的活性成分。鑒于傳統(tǒng)的熱水浸提法存在的這些缺點(diǎn)，很有必要找到一種耗時(shí)少、操作方便且提取率高的實(shí)驗(yàn)方法。采用超聲波輔助酶法提取菊糖，這種方法耗時(shí)短，而且超聲波的強(qiáng)烈振動(dòng)以及空化效應(yīng)可以使有效成分迅速進(jìn)入溶劑，從而有利于菊糖的提取。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化菊糖的提取條件，從而為菊糖的工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋 山西省汾陽(yáng)市品種；C8260-1纖維素酶R- 10（10 U/mg）、P8180-100果膠酶（40 U/mg） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16A-WS高速離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；奧立龍MODEL868酸度計(jì)、SP-2000UV型紫外分光光度計(jì) 上海光譜有限公司；AL204型電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；HH-4恒溫水浴鍋浙江國(guó)華電器公司；SP-040ST超聲波清洗機(jī) 廣州潔盟超聲波設(shè)備有限公司；XF50實(shí)驗(yàn)室粉碎機(jī) 吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 可溶性總糖含量的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用蒽酮比色法在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（回歸方程y=0.006 5x—0.035 7，R2=0.999 0），求出總糖質(zhì)量，按式（1）計(jì)算菊芋中可溶性總糖含量[11]。

式中：C為在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中查出的糖含量/μg；V總為提取液的總體積/mL；V測(cè)為測(cè)定時(shí)取用液體體積/mL；D為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量/g。

1.3.2 還原糖含量的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用3,5-二硝基水楊酸比色法在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（回歸方程y=0.930 5x—0.038 73，R2=0.999 2），求出還原糖質(zhì)量，按式（2）計(jì)算菊芋中還原糖含量[12]。

1.3.3 提取工藝流程

菊芋塊莖→切片→50 ℃烘干→粉碎→過(guò)80 目篩→樣品→超聲波輔助復(fù)合酶酶解→滅酶10 min→過(guò)濾→上清液（粗提液）

1.3.4 復(fù)合酶比例的篩選

準(zhǔn)確稱(chēng)取果膠酶和纖維素酶，使其質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，配制成0.1 mg/mL的復(fù)合酶酶解液，離心，取上清液放置4 ℃冰箱中備用。

分別稱(chēng)取一定量的菊粉，加入2 mL上述配制好的復(fù)合酶酶解液，再加入等體積的蒸餾水，在超聲功率240 W、超聲溫度50 ℃的條件下超聲30 min，按式（3）計(jì)算菊糖得率。

1.3.5 菊糖粗提液提取的單因素試驗(yàn)

采用控制變量法，分別研究料液比、pH值、超聲溫度、超聲時(shí)間、加酶量5 個(gè)因素對(duì)菊糖得率的影響[13]。

1.3.5.1 料液比對(duì)菊糖得率的影響

固定超聲功率240 W、超聲溫度40 ℃、pH 5.5、加酶量40 ?g/g，在料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）條件下超聲提取20 min，90℃滅酶10 min，過(guò)濾，測(cè)定上清液中總糖和還原糖的含量，計(jì)算上清液菊糖得率。

1.3.5.2 pH值對(duì)菊糖得率的影響

固定超聲溫度40 ℃、加酶量40 ?g/g、料液比1∶20（g/mL），pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5條件下超聲提取20 min，90 ℃滅酶10 min，過(guò)濾，計(jì)算上清液中菊糖得率。

1.3.5.3 超聲溫度對(duì)菊糖得率的影響

固定pH 5.5、加酶量40 ?g/g、料液比1∶20（g/mL），超聲溫度分別為35、40、45、50、55 ℃條件下超聲提取20 min，90 ℃滅酶10 min，過(guò)濾，計(jì)算上清液中菊糖得率。

1.3.5.4 聲時(shí)間對(duì)菊糖得率的影響

固定超聲溫度50 ℃、pH 5.5、加酶量40 ?g/g、料液比1∶20（g/mL），超聲時(shí)間分別為10、15、20、25、30 min條件下提取，90 ℃滅酶10 min，過(guò)濾，計(jì)算上清液中菊糖得率。

1.3.5.5 加酶量對(duì)菊糖得率的影響

固定超聲溫度50℃、pH 5.5、料液比1∶20（g/mL），加酶量分別為0、40、80、120、160 ?g/g條件下超聲提取25 min，90 ℃滅酶10 min，過(guò)濾，計(jì)算上清液中菊糖得率。

1.3.6 Plackett-Burman篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素基礎(chǔ)上，對(duì)五因素進(jìn)行因素篩選試驗(yàn)，確定顯著影響因素。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)所確定的因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，確定最佳菊糖提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶比例的篩選

從圖1可以看出，當(dāng)m（果膠酶）：m（纖維素酶）為1∶4時(shí)，菊糖得率最高。當(dāng)其質(zhì)量比為1∶5時(shí)，菊糖得率會(huì)減小。這是可能因?yàn)楫?dāng)纖維素酶質(zhì)量濃度增加到一定程度時(shí)，使得酶活性降低，對(duì)纖維素的酶解能力減弱，導(dǎo)致菊糖得率降低[14]。所以選擇復(fù)合酶（果膠酶和纖維素酶）質(zhì)量比為1∶4。

2.2 菊糖粗提液提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)菊糖得率的影響

從圖2可以看出，料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，菊糖得率最低，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)菊糖得率達(dá)到最高，之后隨著溶劑用量的增加，菊糖含量反而下降。因?yàn)殡S著溶劑用量的增大，溶液中底物和酶的質(zhì)量濃度也隨之下降，有效反應(yīng)碰撞減少，所以最佳料液比為1∶20（g/mL）。

2.2.2 pH值對(duì)菊糖得率的影響從圖3可以看出，pH 5.5時(shí)，菊糖得率最高，因?yàn)閜H 5.5可能是復(fù)合酶的最適pH值，當(dāng)pH值增大后，改變了酶的空間構(gòu)象[15]，從而使酶的活性下降。

2.2.3 超聲溫度對(duì)菊糖得率的影響

從圖4可以看出，隨著超聲溫度的升高，菊糖得率也隨著增大，在超聲溫度為50℃時(shí)，菊糖得率達(dá)到最大，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高后，菊糖得率卻急劇下降。這是因?yàn)闇囟壬撸箯?fù)合酶失活，從而導(dǎo)致菊糖得率下降[16-17]。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)菊糖得率的影響

從圖5可以看出，超聲時(shí)間為25 min時(shí)菊糖得率最高，超聲時(shí)間低于25 min時(shí)，菊糖含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)大于25 min時(shí)，菊糖得率反而下降，可能因?yàn)槎嗵窃谳^長(zhǎng)超聲時(shí)間條件下遭到破壞[18]，分解成單糖。

2.2.5 加酶量對(duì)菊糖得率的影響

從圖6可以看出，菊糖得率隨著加酶量的增加而增大，當(dāng)加酶量為120 ?g/g時(shí)，菊糖得率隨著加酶量增大而變得緩慢，可能因?yàn)榇藭r(shí)酶的用量在底物質(zhì)量濃度一定的情況下已經(jīng)達(dá)到飽和，當(dāng)酶用量增大時(shí)，菊糖得率變化很小，所以加酶量為120 ?g/g時(shí)為最佳。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)顯著影響因素的確定

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理及響應(yīng)值

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)5 個(gè)因素（料液比、超聲溫度、加酶量、pH值、超聲時(shí)間）利用Minitab15.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，以菊糖得率為響應(yīng)值，見(jiàn)表1。

2.3.2 關(guān)鍵影響因素的確定

利用Minitab 15.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型方差分析，見(jiàn)表2。

由表2可知，主效應(yīng)的P=0.001＜0.05，決定系數(shù)R2=94.32%，說(shuō)明試驗(yàn)所得的擬合回歸方程達(dá)到顯著性（模型）；校正決定系數(shù)R2Adj=89.59%，表明89.59%的數(shù)據(jù)變異可以用此回歸方程來(lái)解釋?zhuān)虼丝梢暂^好地確定關(guān)鍵影響因素。

由表3可知，因素X2、X3的P值小于0.01，說(shuō)明這兩個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)具有極顯著的影響，因素X5的P值小于0.05，則說(shuō)明其對(duì)試驗(yàn)有顯著性影響，因此，在菊糖提取試驗(yàn)中，顯著影響因素為超聲溫度、加酶量、超聲時(shí)間。故在下一步響應(yīng)面分析中，重點(diǎn)考察超聲溫度、加酶量和超聲時(shí)間的最優(yōu)水平范圍。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)最佳工藝條件的確定

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Minitab 15.0軟件對(duì)菊芋中菊糖得率進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，表4為響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果，其中1～12為析因試驗(yàn)，13～15為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。

對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到菊芋中菊糖得率對(duì)超聲溫度、加酶量、超聲時(shí)間的三元二次回歸方程為：

Y=—3.155 4X22—5.082 9X3

2—15.655 4X5

2+

1.325 0X2X3+4.432 5X2X5—1.365 0X3X5+1.553 8X2—0.640 0X3+0.953 7X5+72.553 3

由表5可知，本試驗(yàn)所選的三元二次回歸模型具有較好的顯著性（P＜0.001），各因素對(duì)菊糖得率不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系（P＞0.05），平方項(xiàng)和交互作用對(duì)該模型具有顯著性（P＜0.05），說(shuō)明這兩項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有極大的影響，決定系數(shù)R2=98.38%，校正決定系數(shù)=95.45%,說(shuō)明該模型能解釋95.45%響應(yīng)值的變化，從失擬項(xiàng)P=0.057＞0.05（不顯著），說(shuō)明可以利用該回歸方程確定最佳菊糖的提取工藝。

從回歸系數(shù)顯著性分析（表6）可以看出，X22對(duì)菊糖得率的影響具有顯著性（P＜0.05），X32、X52、X2X5對(duì)菊糖得率的影響具有極顯著性（P＜0.01），說(shuō)明在該試驗(yàn)中，超聲溫度、加酶量、超聲時(shí)間對(duì)菊糖得率有顯著性影響，而從X22、X32、X52、X2X5也可以看出，它們對(duì)菊糖得率的影響是非線(xiàn)性的。

2.4.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)上述二次多項(xiàng)回歸方程作出的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖，可以直觀地看出超聲溫度，加酶量、超聲時(shí)間對(duì)菊糖得率的影響，如圖7～9所示。

從圖7可以看出，加酶量和超聲溫度的交互作用對(duì)菊糖得率影響不顯著，加酶量110～130 ?g/g、超聲溫度48～53 ℃時(shí)，菊糖得率有最高點(diǎn)。由圖8可以看出，超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用對(duì)菊糖得率影響顯著，超聲時(shí)間23～27 min、超聲溫度43～55 ℃時(shí)，菊糖得率有最高點(diǎn)。由圖9可以看出，加酶量與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)菊糖得率影響也顯著，超聲時(shí)間22～28 min、加酶量100～140 ?g/g時(shí)，菊糖得率有最高點(diǎn)。

綜合圖7～9，三因素對(duì)菊糖得率的影響以及各因素的交互作用與回歸分析一致。利用Minitab15.0中的相應(yīng)優(yōu)化器可以得出菊糖得率最大時(shí)超聲溫度、加酶量、超聲時(shí)間的預(yù)測(cè)工藝，即超聲溫度51.46 ℃、加酶量118.79 μg/g、超聲時(shí)間25.35 min，菊糖最大得率預(yù)測(cè)值為72.82%。

2.4.3 超聲波輔助復(fù)合酶工藝條件的驗(yàn)證及確定

驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，考慮到操作可行性及方便性，將修正最佳提取條件為：超聲溫度51 ℃、加酶量120 ?g/g、超聲時(shí)間25 min。按此條件進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。得到的菊糖得率為72.2%、72.1%、72.2%，平均菊糖得率為72.2%，與預(yù)測(cè)值較接近，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)超聲波輔助復(fù)合酶提取菊糖的實(shí)際提取效果，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman篩選試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析法對(duì)菊糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了加酶量、超聲溫度、超聲時(shí)間為最佳菊糖提取的顯著影響因素，即最佳工藝條件為超聲溫度51 ℃、加酶量120 ?g/g、超聲時(shí)間25 min，在此條件下，菊糖得率為72.2%。

近年來(lái)，酶工程技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物中活性物質(zhì)的提取，因?yàn)橹参锛?xì)胞壁主要是由纖維素、果膠、半纖維素等組成，利用合適的酶，可以使提取條件溫和，不易破壞其他活性成分。所以本實(shí)驗(yàn)主要采用纖維素酶和果膠酶破壞細(xì)胞壁成分，使糖類(lèi)物質(zhì)易于溶出，同時(shí)結(jié)合超聲波，利用超聲波的機(jī)械作用進(jìn)而加速細(xì)胞壁的破裂，促進(jìn)菊芋中菊糖的快速溶出，縮短了提取時(shí)間。超聲波輔助復(fù)合酶提取多糖的方法，在菊糖提取方面還沒(méi)有涉及，但在雙孢菇多糖[19]、半邊蓮多糖[20]的提取上已有了研究，與傳統(tǒng)方法[21]相比，該法在菊糖得率上分別提高了13.9%、70.6%，同時(shí)在提取時(shí)間與溫度上也有了明顯的縮短與降低。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Inulin by Response Surface Methodology

FAN Sanhong, LI Jing, WANG Yayun, HU Ya’nan
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Inulin was ultrasonically extracted from jerusalem artichoke tubers by enzymatic hydrolysis with both pectinase and cellulase. By using single factor and Plackett-Burman designs, temperature, ultrasonication time and enzyme dosage were found to be significant factors influencing the extraction process. The three factors were further optimized by response surface methodology with Box-Behnken design. The results showed that the optimal extraction conditions were determined as a material-to-liquid ratio of 1:20 (g/mL), an extraction temperature of 51 ℃, a total enzyme dosage of 120 ?g/g with m (pectinase):m (cellulase) ratio = 1:4, an ultrasonic treatment time of 25 min, and a pH of 5.5. Experiments conducted under these conditions gave an inulin yield of 72.2%.

ultrasonic treatment; complex enzyme; inulin; response surface methodology

TS218

A

1002-6630（2015）04-0023-06

10.7506/spkx1002-6630-201504005

2014-07-01

山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012011031-4）；山西省高等學(xué)校高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（20111003）

范三紅（1963—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn