大腸菌群快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

蔡盡忠

（廈門華廈職業(yè)學(xué)院，福建廈門361024）

1 引言

大腸菌群為一群在37℃、24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭陰性無芽胞桿菌的統(tǒng)稱[1]。這些細(xì)菌多存在于溫血?jiǎng)游锛S便中，人、畜糞便對(duì)外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。因此，大腸菌群被國(guó)際上公認(rèn)為檢測(cè)各種水質(zhì)、醫(yī)藥及食品在流行病學(xué)上安全性的指示菌[2,3]。如果檢測(cè)到大腸菌群呈陽性結(jié)果，那么便表明食品、藥品或者水質(zhì)存在大腸菌群，已經(jīng)被糞便污染。大腸菌群的數(shù)量與受到的污染程度成正比，數(shù)量越多，受污染越嚴(yán)重。目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要用多管發(fā)酵法來檢測(cè)大腸菌群，多管發(fā)酵法作為一種傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已沿用多年，其準(zhǔn)確性、權(quán)威性無可質(zhì)疑，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且檢測(cè)所需的費(fèi)用較高，已無法滿足人們對(duì)食品、藥品安全現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)的要求[4]，因此，現(xiàn)在食品、藥品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)迫切需要一種更加有效、快速的大腸菌群檢測(cè)方法。近年來，世界各國(guó)針對(duì)大腸菌群的快速、定量檢測(cè)技術(shù)都進(jìn)行了專門的研究[5,6]，本文綜述了大腸菌群快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，并對(duì)其存在問題及應(yīng)用前景進(jìn)行分析。

2 大腸菌群主要的快速檢測(cè)方法

2.1 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)方法檢測(cè)原理是依據(jù)抗原和抗體特異性反應(yīng)[7]。目前用于大腸菌群的免疫學(xué)檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光免疫檢測(cè)、免疫磁珠技術(shù)[8]。

2.1.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA的技術(shù)原理是：將酶分子與抗體（或抗原）結(jié)合，形成穩(wěn)定的酶標(biāo)抗體（或抗原）與固相載體上的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合時(shí)，即可在底物溶液參與下，生成可溶性或不溶性有色物質(zhì)，顏色的深淺與抗原或抗體的量成比例關(guān)系，結(jié)果可用肉眼或酶標(biāo)測(cè)定儀判定。

1989年Obst 等[9]建立了使用識(shí)別腸道菌群共同抗原ECA的單克隆抗體檢測(cè)腸道菌群的ELISA法，樣品經(jīng)增菌至105 cfu/ mL后可以檢出目標(biāo)菌。王玉金等[10]于2012年利用雙抗體夾心法檢測(cè)大腸桿菌O157:H7，結(jié)果得出大腸桿菌O157:H7的最低檢出濃度為1×105cfu/mL，實(shí)驗(yàn)僅在10min內(nèi)完成了檢測(cè)。ELISA法具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但是抗體的特異性、抗原與抗體的濃度和反應(yīng)液常常會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。當(dāng)對(duì)污染比較嚴(yán)重的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，ELISA法存在嚴(yán)重缺陷，主要是很可能受到其它存在的細(xì)菌的影響而降低方法的特異性。

2.1.2熒光免疫檢測(cè)（FIA）

熒光免疫檢測(cè)技術(shù)是將不影響抗原抗體活性的熒光素標(biāo)記在抗原（或抗體）上，與其相應(yīng)的抗體（或抗原）結(jié)合后，通過熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，推算待測(cè)物質(zhì)的濃度。1999年Rockabrand等[11]發(fā)明了一種革命性的FIA法，他們使用針對(duì)大腸桿菌不同生長(zhǎng)周期胞漿中合成的特異性蛋白的單克隆抗體，用熒光物質(zhì)標(biāo)記這些單克隆抗體。

IFA是一種新興的檢測(cè)技術(shù)，由于大腸菌群的成員的復(fù)雜性，使用該技術(shù)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)對(duì)全

部大腸菌群的檢測(cè)需要制備大量成員中不同菌種的單克隆或多克隆抗體，具有一定的困難性。而對(duì)于大腸桿菌的檢測(cè)技術(shù)日趨成熟，但在提高抗體的特異性，避免其它細(xì)菌發(fā)生交叉感染方面還有待于進(jìn)一步提高。

2.1.3免疫磁珠技術(shù)（IMB）

免疫磁珠技術(shù)應(yīng)用磁珠作為抗體載體，通過抗體抗原結(jié)合在磁力作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，而達(dá)到分離特異性抗原的目的[12]。磁性微球與微生物的特異性抗體產(chǎn)生偶聯(lián)，再將微球加到待檢測(cè)標(biāo)本的液體中，相應(yīng)微生物就會(huì)與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，在磁場(chǎng)作用下，可將微生物從磁性微球上解離下來，進(jìn)行 PCR 或熒光染色檢驗(yàn)[13]。Martin等[14]應(yīng)用此法從病人糞便中分離出多株山梨醇陽性O(shè)157:H7大腸桿菌。該方法特異性好、敏感度高，但操作復(fù)雜，不具備推廣應(yīng)用的能力。

免疫學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是高效，可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。缺點(diǎn)是由于其他微生物共同抗原的干擾，檢測(cè)大腸菌群易出現(xiàn)假陽性，需要制備更高特異性的單克隆抗體或多克隆抗體，一旦菌體發(fā)生變異，檢測(cè)結(jié)果就不準(zhǔn)確，操作繁瑣，成本昂貴。

2.2 酶學(xué)技術(shù)

與傳統(tǒng)方法相比，微生物酶譜分析法具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)所檢測(cè)酶類的不同，可以分辨出大腸菌群的群、屬、種，反應(yīng)也更加快速、敏感。其原理是培養(yǎng)基含有的熒光或顯色底物在細(xì)菌特異性酶的作用下，產(chǎn)生熒光或顯示一定顏色，一次完成目標(biāo)菌的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和鑒定[15]。常用β-葡萄糖醛酸酶催化顯色的底物有羥基吲哚-β-D 葡萄糖苷酸（IBDG）和半乳糖苷（X-Glu）；4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷（MUG）為β-葡萄糖醛酸酶催化顯現(xiàn)熒光的底物；5-溴-4-氯- 3-吲哚半乳糖苷（X-Glu）、鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）和對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）用于檢測(cè)β-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，而MUG用于檢測(cè)β-半乳糖苷酶的熒光反應(yīng)[16]。

酶活性檢測(cè)法比傳統(tǒng)方法省時(shí)省力（18～24h），而且特異性更高，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)飲用水、食品中的大腸菌群。因其具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確性高、二次污染小等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被許多國(guó)家寫入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。但是該法成本過高并且容易受到水中消毒劑、食品的處理過程以及培養(yǎng)基中存在的抑菌物質(zhì)的影響，破壞了大腸菌群的正常生長(zhǎng)，使其酶合成的能力下降，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，而且與傳統(tǒng)方法一樣不能解決無法培養(yǎng)的大腸菌群的檢出難題。

2.3 分子生物學(xué)技術(shù)

大多數(shù)分子生物學(xué)方法不需要培養(yǎng)步驟，因此可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，目前常用的檢測(cè)大腸菌群的分子生物學(xué)方法主要有原位雜交（ISH）技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)。

2.3.1原位雜交（ISH）法

原位雜交是將組織化學(xué)與分子雜交相融合的一種技術(shù)，利用合成的大腸菌群RNA或DNA序列互補(bǔ)的探針，與大腸菌群進(jìn)行雜交，即在細(xì)胞、染色體及組織上檢測(cè)特異的RNA或DNA序列，從而特異地檢出大腸菌群。王建龍[17]采用熒光標(biāo)記探針取代同位素探針的熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，專門設(shè)計(jì)針對(duì) 16SrRNA 分子區(qū)域檢測(cè)水樣產(chǎn)品的大腸菌群檢測(cè)探針，可在6～8h內(nèi)給出定量分析結(jié)果。ISH 技術(shù)具有操作快速、簡(jiǎn)便、安全和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物檢測(cè)，能進(jìn)行定性和定量分析。

2.3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是利用耐熱DNA聚合酶的作用，通過變性-延伸-復(fù)性的循環(huán)操作，在體外迅速將 DNA 模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種克隆技術(shù)。王建龍[18]利用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼lacZ基因的DNA片段，可以檢測(cè)大腸菌群。盡管PCR技術(shù)具有高敏感性和特異性，但由于食物組分中可能存在著多種酶的抑制劑，會(huì)影響 PCR 法的檢出率，并且PCR法不能區(qū)分活菌和死菌，很難對(duì)大腸菌群進(jìn)行定量分析。

2.3.3基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)今年來發(fā)展迅速，生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)和化學(xué)等多種學(xué)科被它聯(lián)結(jié)起來，具有很強(qiáng)的交叉性，是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)?；蛐酒前岩呀?jīng)設(shè)計(jì)的基因片段或者寡核苷酸按照一定順序緊密的排列在芯片上，熒光標(biāo)記分子經(jīng)過PCR擴(kuò)增的方式進(jìn)入微生物樣品（大腸桿菌）的DNA，并且與芯片上的寡核酸點(diǎn)進(jìn)行雜交，最后通過熒光波長(zhǎng)掃描儀，利用計(jì)算機(jī)軟件分析得到待測(cè)樣品的含量。

目前基因芯片技術(shù)并未適合全部大腸菌群的檢測(cè)，僅僅局限于大腸桿菌的測(cè)定。祝儒剛等[19]使用基因芯片技術(shù)對(duì)肉制品中的大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測(cè)，過程中編碼了大腸埃希氏菌的基因，選取16SrDNA基因作為陽性對(duì)照，經(jīng)試驗(yàn)證明靈敏度低達(dá)2 pg。賀晨等[20]將該技術(shù)與多重PCR技術(shù)相聯(lián)接，研究了一種檢測(cè)11種致病菌的方法。對(duì)相應(yīng)的引物與探針進(jìn)行設(shè)計(jì)，進(jìn)行多重PCR的擴(kuò)增，制備芯片，將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有探針的基因芯片進(jìn)行雜交，最終得到目標(biāo)細(xì)菌的含量。結(jié)果表明對(duì)大腸桿菌的特異性檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到2×10-3ng。

基因芯片技術(shù)具有快捷、靈敏度高、操作方便等特點(diǎn)，逐漸成為熱門研究領(lǐng)域。其最值得關(guān)注的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法無法識(shí)別死菌，而基因芯片技術(shù)可以將死菌的DNA識(shí)別出來。

2.4 傳統(tǒng)檢測(cè)方法改進(jìn)技術(shù)

2.4.1膜過濾技術(shù)

大腸菌群通常菌體長(zhǎng)2～3μm，寬 0.5～0.8μm，當(dāng)用孔徑為0.45μm 濾膜過濾時(shí)水可以通過，而大腸菌則被截留下來。然后把濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，計(jì)數(shù)膜上生長(zhǎng)出的典型細(xì)菌菌落。膜過濾法已經(jīng)被很多國(guó)家作為標(biāo)準(zhǔn)方法，主要應(yīng)用于水質(zhì)檢測(cè)中，例如中國(guó)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局對(duì)入出境船舶壓能水中的大腸菌群的檢測(cè)，德國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)學(xué)會(huì)以及日本發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)都使用膜過濾法做為檢測(cè)水中大腸桿菌和耐熱大腸桿菌以及其它種類大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)方法。

膜過濾技術(shù)屬于定量試驗(yàn)，其最大的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)較大體積的水樣時(shí)，檢出的敏感度和可靠性較傳統(tǒng)方法有明顯提高；缺點(diǎn)是受水樣中其他細(xì)菌干擾，特異性不高，易出現(xiàn)假陽性檢測(cè)結(jié)果，需進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)才能最終確定，尤其當(dāng)飲用水消毒處理后，會(huì)使其中的大腸菌群受到損傷，致使不能在選擇性培養(yǎng)基中長(zhǎng)出菌落，降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.4.2快速測(cè)試片法

大腸菌群快速紙片法檢測(cè)原理是將適量的乳糖、指示劑溴甲酚紫和 （TTC）菌體生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)成分以及革蘭氏陽性菌抑菌劑吸附于一定面積的無菌濾紙上，大腸菌群生長(zhǎng)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使pH值降低，溴甲酚紫指示劑由紫色變黃色，在紙片上呈現(xiàn)出黃色反應(yīng)，同時(shí)菌體中含有的脫氫酶還原TTC形成紅色不溶性紅四氮唑，顯出紅色斑點(diǎn)[21]，以同時(shí)滿足這兩種特性作為陽性結(jié)果的唯一判定標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.3Hygieut載片培養(yǎng)法

Hygieut載片培養(yǎng)法是一種結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂載片，在一塊帶折頁設(shè)計(jì)的塑料槳片上澆注適合于大腸菌群快速生長(zhǎng)的瓊脂培養(yǎng)基，樣品表面能與培養(yǎng)基方便、充分地接觸，載片上帶有帽蓋，可以使載片在無污染情況下放回到無菌培養(yǎng)管中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和培養(yǎng)。大腸菌群能夠分解瓊脂載片上的乳糖產(chǎn)酸，產(chǎn)氣并產(chǎn)生其他特征性的形態(tài)和顏色變化，從而通過目測(cè)，即可對(duì)大腸菌群菌落數(shù)進(jìn)行定性或定量的快速檢測(cè)。

2.4.4試劑盒法

試劑盒法是按照國(guó)家食品、水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法-多管發(fā)酵方法研制而成。其原理是將液體乳糖培養(yǎng)基經(jīng)固化加工后，置于特制透明塑料盒中，兩者組成試劑盒。王世平等[22]根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究大腸菌群檢測(cè)進(jìn)展和研究成果，研發(fā)出大腸菌群快速檢測(cè)試劑盒，現(xiàn)已批量生產(chǎn)，并于2006年獲國(guó)家技術(shù)專利。試劑盒法操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果判定清晰準(zhǔn)確、成本低廉，便于攜帶和保存。通過試驗(yàn)測(cè)試，證實(shí)試劑盒法與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果無明顯差異，是一種科學(xué)、實(shí)用、可靠的檢測(cè)方法，適用于食品、水質(zhì)大腸菌群的檢測(cè)。

2.5 物理化學(xué)技術(shù)

2.5.1電阻抗法

電阻抗法檢測(cè)大腸菌群的原理當(dāng)大腸菌群在培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖時(shí)，大腸菌群的新陳代謝作用導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生變化，電惰性物質(zhì)包括糖轉(zhuǎn)化為乙酸、乳酸，蛋白質(zhì)分解為氨基酸，脂肪轉(zhuǎn)化為重碳酸鹽，這時(shí)培養(yǎng)基中的電導(dǎo)性有所加強(qiáng)而電阻抗能力下降，因此可以知道通過測(cè)量培養(yǎng)基內(nèi)電阻抗的改變即可獲得大腸菌群的數(shù)量[23]。不同數(shù)量的大腸菌群呈現(xiàn)出不同的指數(shù)期，兩者之間具有一定聯(lián)系，確定這種聯(lián)系后大腸菌群的數(shù)量便可通過記錄電阻抗值獲得。當(dāng)樣品中大腸菌數(shù)量較多時(shí)，3～4h即可獲得阻抗信號(hào)，而當(dāng)樣品中大腸菌數(shù)為較少時(shí)獲得信號(hào)需要較長(zhǎng)時(shí)間，如果每毫升只有1個(gè)大腸菌群甚至需要10h。李小燕等[24]在進(jìn)行牛奶中大腸菌群的測(cè)定時(shí)使用了電阻抗法，當(dāng)每毫升牛奶中的大腸菌群數(shù)量達(dá)到十萬個(gè)時(shí)，4h即可完成檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法相比速度快且差異不顯著。Martin等[24]將電阻抗法應(yīng)用于肉制品中的大腸菌群的檢測(cè)，Colquhoun等[25]將電阻抗法用于飲用水中大腸桿菌的檢測(cè)，都得到了較佳的結(jié)果。J.Dupont[26]使用阻抗法檢測(cè)海洋中貝類動(dòng)物中大腸桿菌的數(shù)量，5～9h內(nèi)即可得到測(cè)定結(jié)果。電阻抗法方便易行、耗時(shí)短并且可以連續(xù)對(duì)培養(yǎng)基中大腸菌群的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行測(cè)量。但該法的靈敏度會(huì)隨待檢樣品中菌數(shù)濃度的高度而有所變化。當(dāng)樣品中大腸菌群污染量低時(shí)檢出的時(shí)間較長(zhǎng)，樣品中菌量越高則檢測(cè)時(shí)間越短，最低檢測(cè)限較高。此外該法成本較高，需要特殊的流體與電熱調(diào)節(jié)并且特異性和選擇性也較差。

2.5.2生物傳感器法

生物傳感器的主要特征是對(duì)生物物質(zhì)敏感，生物物質(zhì)的濃度可以被相應(yīng)的轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。生物傳感器主要由以下三個(gè)部分組成：識(shí)別元件，主要包括抗體、抗原、酶、微生物、組織、細(xì)胞、核酸等生物活性物質(zhì)；換能器，主要包括氧電極、場(chǎng)效應(yīng)管、壓電晶體、光敏管等還有信號(hào)方法裝置。生物傳感器具有簡(jiǎn)便、體積小、成本低、靈敏度高、專一性強(qiáng)及抗干擾能力強(qiáng)、響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn), 目前其在食品安全檢測(cè)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[27]。張文浩等[28]研究的生物傳感器主要基于表面等離子體共振原理，以酸菜發(fā)酵液為對(duì)象進(jìn)行了大腸桿菌的檢測(cè)，通過捕捉傳感器的折射率建立方程，最終得到大腸桿菌的數(shù)量，該方法檢出限能夠達(dá)到104cfu/mL。

2.5.3化學(xué)發(fā)光法

日本的Susumu Kawasaki[29]使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)牛乳中的大腸菌群。主要原理是將大腸菌群接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后添加醌類化合物（甲萘醌）時(shí)，醌類化合物作為氧化還原催化劑，使培養(yǎng)液中的氧還原，最終生成活性氧。同時(shí)，在這種含有活性氧的培養(yǎng)液中添加發(fā)光試劑（魯米諾）時(shí)會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，細(xì)胞活性就能被檢測(cè)出來。梁玉冰[30]對(duì)大腸菌群數(shù)目與發(fā)酵液顏色之間的變化進(jìn)行研究，分析了大腸菌群在發(fā)酵過程中顏色所發(fā)生的變化，與大腸菌群數(shù)量建立了關(guān)系模型，最終得到了快速計(jì)數(shù)大腸菌群的比色試紙。

2.6 其它技術(shù)

2.6.1全自動(dòng)系統(tǒng)

法國(guó)梅里埃集團(tuán)生產(chǎn)的全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)（VITEKAMS）能夠?qū)?xì)菌做出鑒定，做出鑒定的基礎(chǔ)是每種細(xì)菌的微量生化反應(yīng)。楊毓環(huán)等[31]使用VITEK-AMS系統(tǒng)對(duì)已知的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與已知的全部符合。對(duì)腸科桿菌的鑒定與常規(guī)方法比較，符合率為95.06%。VITEK-AMS不同于以往的培養(yǎng)方法，而是將檢測(cè)鑒定技術(shù)與現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合，使檢驗(yàn)工作實(shí)現(xiàn)了高效、快捷、自動(dòng)、科技化，大大的提高了效率，減少了人力物力的浪費(fèi)。

2.6.2ATP生物發(fā)光法

ATP生物發(fā)光技術(shù)是近年來被逐漸應(yīng)用于快速檢測(cè)中的一種新方法，在大腸菌群的檢測(cè)中有著廣泛應(yīng)用。目前常用的方法是熒光素酶-ATP法，該方法是由McEloyr[32]出的，其原理是在ATP參與下，熒光素酶和氧氣為反應(yīng)基底物質(zhì)，熒光素被氧化使得化學(xué)能變?yōu)楣饽埽⑨尫殴饬孔?。每一分子的ATP都會(huì)產(chǎn)生一分子的光量子，發(fā)光強(qiáng)度與ATP的濃度呈正相關(guān)。使用光強(qiáng)度測(cè)量?jī)x器側(cè)得熒光強(qiáng)度即可得到ATP的濃度，而每個(gè)細(xì)胞的中的ATP含量幾乎是一致，由此可推算出大腸菌群的數(shù)量。該方法的操作步驟主要分為[33]：樣品的采集和ATP的提取、熒光素酶的添加、發(fā)光量的測(cè)定最后求出濃度并算出大腸菌群數(shù)量，除此之外，在測(cè)定樣品時(shí)應(yīng)使用表面活性劑對(duì)樣品進(jìn)行ATP萃取，因?yàn)锳TP被細(xì)胞膜和細(xì)胞壁包圍，表面活性劑能夠使ATP釋放出來。曹麗蓉等[34]使用該方法對(duì)282份食品進(jìn)行檢測(cè)，生物發(fā)光法的陽性率和大腸菌群的陽性率無顯著差異（P> 0.05）。王東黎等[35]采用此法測(cè)定能量物質(zhì)，無論是細(xì)菌還是食物樣品，ATP含量均與其發(fā)光值存在極高的線性關(guān)系（R>0.99）。M.Niksic等[36]將該法與傳統(tǒng)的微生物方法進(jìn)行比較，結(jié)果證明二者具有高度相關(guān)性。ATP生物發(fā)光法檢測(cè)大腸菌群具有快速、測(cè)定范圍廣、攜帶方便、能夠進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)作等優(yōu)點(diǎn)。但該法也存在較多缺點(diǎn)，比如游離ATP和體細(xì)胞的干擾性較強(qiáng)、檢出限較低、易受鹽等成分干擾等缺點(diǎn)。

2.6.3培養(yǎng)基顯色法

丁筠等[37]建立了一種快速檢測(cè)大腸菌群數(shù)的方法，試驗(yàn)以乳糖膽鹽培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中加入微涼的伊紅美蘭溶液作為顏色變化的指示劑，通過分光光度計(jì)，最終得到大腸菌群數(shù)量與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該法精密度RSD小于2.75%，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間并使準(zhǔn)備操作簡(jiǎn)單易行。

3 結(jié)語

傳統(tǒng)的大腸菌群檢測(cè)方法往往具有實(shí)驗(yàn)量大，步驟復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢出限地、靈敏度差以及成本高等缺點(diǎn)，而近年來發(fā)展大腸菌群的快速檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法、免疫膠體金法、PCR 法、快速測(cè)試片及試劑盒法等，從上述的分析可以看出，這些方法雖然解決了時(shí)間問題，但在檢測(cè)敏感性、特異性、重復(fù)性以及操作上存在這樣或那樣的問題，沒有一種方法能夠真正達(dá)到成本低、靈敏度好、準(zhǔn)確性高并且檢測(cè)速度快的要求。并且這些方法的成本都比較昂貴，不適用于基層實(shí)驗(yàn)室的使用。因此要真正實(shí)現(xiàn)大腸菌群的快速檢測(cè)還需要不斷進(jìn)行科學(xué)研究，以尋找更合適的方法。

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