手性高效液相色譜法測(cè)定左卡尼汀片中右旋卡尼汀的含量

谷春秀，程夢(mèng)威，劉露，于亞萌，張童，鮑尹聰

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023）

引言

左卡尼汀作為一種有效的活性氧物質(zhì)清除劑，可加快缺血缺氧組織堆積的脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體內(nèi)，在緩解氧化應(yīng)激、減少脂質(zhì)過(guò)氧化、釋放腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶、促進(jìn)脂類代謝、抗細(xì)胞凋亡等過(guò)程中作用明顯[1～5]。左卡尼?。↙-carnitine, LCA），又稱左旋肉堿。肉堿分子中含有1個(gè)手性碳原子（見(jiàn)圖1），形成左旋（L-）、右旋（D-）肉堿對(duì)映異構(gòu)體。右旋肉堿對(duì)肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）和肉堿脂肪酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，在生化過(guò)程中產(chǎn)生毒副作用[6,7]。左卡尼汀片中雜質(zhì)右旋卡尼汀的存在明顯影響藥品質(zhì)量的安全有效。藥品中右旋卡尼汀含量超標(biāo)容易產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)，造成患者惡心和嘔吐、甚至過(guò)敏反應(yīng)，大劑量的情況下對(duì)人和動(dòng)物有害[6]。美國(guó)FDA于1993年就禁止出售D-型和DL-型肉堿[7]。國(guó)內(nèi)外目前對(duì)左卡尼汀片中右旋卡尼汀測(cè)定的研究報(bào)導(dǎo)較少。分離卡尼汀對(duì)映體時(shí)須用手性拆分技術(shù)，酶解[8]、手性衍生化[9～11]、手性固定相[11]法常被用于左右旋肉堿拆分。國(guó)外尚未有左旋肉堿對(duì)映體拆分后含量檢測(cè)的研究報(bào)道。美國(guó)藥典25版及藥典論壇和其他文獻(xiàn)資料對(duì)左卡尼汀中手性雜質(zhì)控制方法有少量的報(bào)道[12]，也曾提供過(guò)方法和檢測(cè)限度，都是衍生后用HPLC分析，但是過(guò)程復(fù)雜，重復(fù)性較差，根據(jù)《手性藥物質(zhì)量控制研究指導(dǎo)原則》、美國(guó)藥典25版及其論壇（pharmacopeial forum）左卡尼汀專論部分規(guī)定控制了左卡尼汀原料右旋體的限度，限度為1.0%。國(guó)內(nèi)在此方面的研究仍是空白。左卡尼汀片雜質(zhì)右旋卡尼汀含量的測(cè)定方法研究，為市售左卡尼汀中雜質(zhì)限量、質(zhì)量控制提供技術(shù)支持，促進(jìn)此類制藥生產(chǎn)的良性運(yùn)作。

圖1肉堿的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津2010HT高效液相色譜儀（日本島津公司）； 2140型電子分析天平（上海奧豪斯公司）Mettler AB135 -S十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

左卡尼汀片（批號(hào)：120901, 120902, 120903）北京嘉事大恒制藥有限公司；對(duì)照品DL-肉堿（批號(hào)：20111201純度為98.69%）武漢福鑫化工有限公司；乙腈為色譜純（J.T.Baker公司）；高氯酸鈉為分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；高氯酸為分析純（天津政成化學(xué)制品有限公司）；α-溴代苯乙酮（MW=199.04）為化學(xué)純（批號(hào)：T20110602）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鉀、無(wú)水冰醋酸為分析純（北京化工廠）；醋酐為分析純（天津多利精細(xì)化工有限公司）；水為純化水。

1.3 溶液制備

1.3.1樣品衍生化制備供試液

取一定濃度的左卡尼汀33%的乙醇溶液10mL置100ml圓底燒瓶中，搖勻后，向其中滴加一滴酚酞指示液，加入一滴1mol/L的KOH溶液，使之紫紅色不退，加入а-溴代苯乙酮（MW=199.04）26.0mg，搖勻后，加熱回流，使圓底燒瓶中液體保持微沸，從冷凝管流出液體開(kāi)始計(jì)時(shí)，加熱回流30min，回流過(guò)程中不時(shí)振搖溶液，冷卻至室溫后，向圓底燒瓶中加入50ml乙酸乙酯，混合搖勻，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，搖勻靜置后，取下層水相作為備用溶液，精密移取此備用液1.0ml，置5ml容量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得供試液。

1.3.2空白衍生溶液

精密移取33%的乙醇溶液10ml置100ml圓底燒瓶中，按樣品衍生化過(guò)程衍生后，得下層水相備用液，精密移取此備用液1.0 ml，置5ml量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得供試液衍生溶液。

1.3.3空白輔料衍生溶液

精密稱取處方量的輔料約2.2g，置100ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密移取離心后的上述溶液的上清液2.0mL置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，按樣品衍生化過(guò)程衍生后，得到下層水相備用液，精密移取此備用液1.0ml，置5ml量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得空白輔料衍生溶液。

1.3.4左卡尼汀片(L-carnitine tablets)供試溶液

取左卡尼汀片20片（批號(hào)：120901）精密稱定，研細(xì)，精密稱取藥物粉末適量（約相當(dāng)于左卡尼汀2.5g），置100ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度后按1.3.2方法處理后加入水稀釋至刻度，即得左卡尼汀片供試衍生溶液。

1.3.5右卡尼?。―-carnitine）對(duì)照衍生溶液

精密稱定DL-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品約100mg（相當(dāng)于D-carnitine對(duì)照品50mg），置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密移取上述溶液5.0ml，置100ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密移取上述溶液5.0mL置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。按樣品衍生化過(guò)程衍生后，得到下層水相備用溶液，精密移取此備用溶液1.0ml，置5ml量瓶中，加入水稀釋至刻度，即得右卡尼汀（D-carnitine）對(duì)照衍生溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱為phenomenex LUX Cellulose-1（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為0.5mol/L高氯酸鈉溶液（0.1M高氯酸溶液調(diào)節(jié)PH值3.8）；梯度洗脫見(jiàn)表1；柱溫為28℃；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm；流速為0.4mL·min-1，進(jìn)樣量為10μl。

表1梯度洗脫程序

1.5 測(cè)定方法

1.5.1專屬性實(shí)驗(yàn)

精密移取離心后的左卡尼汀片（L-carnitinetablets）供試溶液上清液2.0ml和右卡尼?。―-carnitine）對(duì)照溶液5.0ml，各置25ml量瓶中，加33%的乙醇溶液稀釋至刻度，得到左卡尼?。↙-carnitine）供試液和D-carnitine對(duì)照供試液。進(jìn)行衍生過(guò)程試驗(yàn)，即得左卡尼汀供試衍生溶液和D-carnitine對(duì)照衍生溶液，同法制備空白溶劑衍生溶液和空白輔料衍生溶液。按色譜條件進(jìn)行分析。記錄色譜圖。

1.5.2系統(tǒng)適用性

精密移取右旋卡尼?。―-carnitine）對(duì)照溶液衍生后的溶液，分別進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以6次的峰面積計(jì)算RSD%值。

1.5.3樣品測(cè)定右卡尼汀參照高效液相色譜法（附錄V D）測(cè)定（1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用纖維素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）硅膠鍵合相手性色譜柱（Phenomene Lux 5u Cellulose-1色譜柱），以0.5mol/l高氯酸鈉溶液（用高氯酸調(diào)節(jié)PH3.8）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.4ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為235nm，柱溫28℃。精密量取供試衍生溶液和對(duì)照衍生溶液各10.0μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，若供試衍生溶液中有右旋卡尼汀衍生物峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

（2）測(cè)定方法

左卡尼汀供試品溶液見(jiàn)1.3.4，D-carnitine對(duì)照品溶液見(jiàn)1.3.5。精密移取供試品溶液和對(duì)照品溶液分別10ml，各置100ml圓底燒瓶中，搖勻后，各滴加一滴酚酞指示液按1.3.2得對(duì)照品、供試品衍生溶液。照上述條件同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1線性與范圍

分別精密移取專屬性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的D-carnitine 對(duì)照品衍生備用溶液0.10ml、0.20ml、0.40ml、0.80ml、1.00ml、1.20ml各置5ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得線性測(cè)定1～6號(hào)溶液，各精密移取上述線性測(cè)定1～6號(hào)溶液各10.0μl，按色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.6.2重復(fù)性

右卡尼汀對(duì)照品衍生溶液同1.3.5，供試品衍生溶液同1.3.4，平行制備6份供試樣品衍生溶液。分別取上述對(duì)照品衍生溶液和供試品衍生溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.6.3溶液穩(wěn)定性

在室溫條件下將供試品衍生溶液同1.3.4放置于0、2、6、10、12小時(shí)分別進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖。

1.6.4回收率

各平行制備三份低、中、高濃度加標(biāo)供試樣品衍生溶液（n=9)。取右卡尼汀(D-carnitine)對(duì)照品衍生溶液及低、中、高濃度加標(biāo)供試樣品衍生溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.6.5耐用性

按照個(gè)人所得稅法有關(guān)規(guī)定，農(nóng)民進(jìn)城務(wù)工勞務(wù)所得、經(jīng)營(yíng)所得、工資所得等，收入達(dá)到個(gè)稅起征要求也需要繳納個(gè)人所得稅，如月工資、薪金超過(guò)5000元需繳納個(gè)稅，勞務(wù)報(bào)酬每次超過(guò)800元需繳納個(gè)稅等。但是進(jìn)城務(wù)工人員工作相對(duì)不易，與城鎮(zhèn)居民納稅人又承擔(dān)相等的納稅義務(wù)，稅負(fù)較重，進(jìn)城后生活狀況改善有限，整體公平性并未實(shí)現(xiàn)。

精密移取對(duì)照品衍生溶液見(jiàn)1.3.5、供試品衍生溶液見(jiàn)1.3.4各10μl注入色譜儀中，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與與討論

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2匯總表。記錄色譜圖見(jiàn)圖2。

表2專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總表

*N/A表示不適用，圖譜中未出現(xiàn)該右卡尼汀衍生物色譜峰

專屬性試驗(yàn)圖譜如下：

圖2專屬性試驗(yàn)譜圖圖中阿拉伯?dāng)?shù)字1表示為空白衍生溶液色譜圖2表示為空白輔料衍生溶液色譜圖3表示為供試品衍生溶液色譜圖4表示為對(duì)照品衍生溶液色譜圖

空白輔料、空白溶劑不干擾供試品中右卡尼汀衍生物峰的測(cè)定，對(duì)照品及供試品中右卡尼汀衍生物峰峰形良好，理論塔板數(shù)大于5000，右卡尼汀衍生物峰與左卡尼汀衍生物峰分離度大于1.5，因此表明本方法專屬性好。

2.2 系統(tǒng)適用性

以6次的峰面積計(jì)算RSD%，結(jié)果見(jiàn)表3。

右卡尼汀衍生物峰與左卡尼汀衍生物峰峰形良好，兩峰分離度大于1.5，右卡尼汀衍生物峰理論塔板數(shù)大于5000，峰面積及峰保留時(shí)間RSD%（n=6）均小于2.0%，表明本方法系統(tǒng)適用性較好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性與范圍

表3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總

表4線性與范圍試驗(yàn)結(jié)果匯總表

圖3線性范圍關(guān)系圖

由以上試驗(yàn)可知，右卡尼汀在濃度1.978μg/ml～23.741μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A=4652C+282.70，相關(guān)系數(shù)r=1，完全滿足左卡尼汀片中右卡尼汀手性雜質(zhì)的檢查要求。

2.3.2定量限、檢測(cè)限

根據(jù)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)項(xiàng)下對(duì)照品衍生溶液色譜圖信噪比(S/N）為1109.36，將線性1號(hào)溶液稀釋10倍，即可得到定量限，這時(shí)稀釋樣品圖譜的信噪比為9.68，可以作為定量限樣品溶液。將線性1號(hào)溶液稀釋50倍，即可得到檢測(cè)限，這時(shí)稀釋樣品圖譜的信噪比為2.22，可以作為檢測(cè)限樣品溶液。因此方法檢測(cè)的定量限為1.98ng，相當(dāng)于定量檢測(cè)左卡尼汀片中手性雜質(zhì)右卡尼汀的限度為0.01%,檢測(cè)限為0.4ng，相當(dāng)于最低檢測(cè)左卡尼汀片中手性雜質(zhì)右卡尼汀的限度為0.002%，遠(yuǎn)低于規(guī)定左卡尼汀片中手性雜質(zhì)右卡尼汀的限度1.0%的要求，說(shuō)明本檢測(cè)方法靈敏度高，符合樣品檢測(cè)右卡尼汀手性雜質(zhì)的要求。

圖4線性測(cè)定色譜圖

2.3.3重復(fù)性

分別取1.6.2對(duì)照品衍生溶液和供試品衍生溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果匯總表

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性良好。

2.3.4溶液穩(wěn)定性

考察供試品衍生溶液穩(wěn)定性，計(jì)算右卡尼汀衍生物色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果匯總表

試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品衍生測(cè)定溶液放置12小時(shí)后，峰面積RSD=0.74%，同時(shí)色譜峰能完全分離，說(shuō)明供試品衍生測(cè)定溶液在室溫條件下至少12小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.5回收率

取右卡尼?。―-carnitine）對(duì)照品衍生溶液及低、中、高濃度加標(biāo)供試樣品衍生溶液（n=9同1.6.4）各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7不同濃度回收率結(jié)果

以上結(jié)果表明，高、中、低三個(gè)濃度9個(gè)加標(biāo)供試測(cè)定溶液的加樣回收率均在80%～120%之間，回收率平均值為97.83%，RSD值為5.0%，說(shuō)明回收率良好。

2.3.6耐用性

取對(duì)照品衍生液、供試品衍生液各10μl進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，耐用性試驗(yàn)結(jié)果如表8。

表8耐用性試驗(yàn)結(jié)果

改變流速、柱溫、流動(dòng)相比例、PH值，供試品溶液中右卡尼汀測(cè)定結(jié)果為0.07±0.02%，說(shuō)明本法耐用性較好。

在耐用性實(shí)驗(yàn)前為考察色譜條件的微小變化對(duì)本品中右卡尼汀手性雜質(zhì)檢查結(jié)果的影響，分別考察了流速、柱溫、流動(dòng)相比例、流動(dòng)相PH值的變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響：

①改變流速±10%（1、0.3ml/min；2、0.4ml/min）

②改變柱溫±5℃（1、23℃；2、33℃）

③改變初始流動(dòng)相有機(jī)相比例±5%（1、高氯酸鈉溶液：乙腈=73:27；2、高氯酸鈉溶液：乙腈=83: 17）

④改變PH±0.2（1、pH 3.6；2、pH 4.0）

實(shí)驗(yàn)中采用梯度洗脫，隨著乙腈比例的增加，保留時(shí)間縮短較快。高效液相色譜法在對(duì)映異構(gòu)體的分析中較為常用，但可用于L-肉堿與D-肉堿分析的方法卻較少[7,13～17]。主要由于肉堿極性很大，在色譜柱上保留不好，同時(shí)在紫外可見(jiàn)光區(qū)吸收極弱，靈敏度不夠。

2.4 樣品測(cè)定

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品衍生溶液10μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，右卡尼汀衍生物峰理論塔板數(shù)計(jì)算不低于5000，左卡尼汀衍生物峰與右卡尼汀衍生物峰分離度應(yīng)不小于1.5，調(diào)節(jié)右卡尼汀衍生物峰高為滿量程10%～20%。精密量取供試衍生溶液和對(duì)照衍生溶液各10.0μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，若供試衍生溶液中有右旋卡尼汀衍生物峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得則不得過(guò)1.0%。

測(cè)定法 三批樣品照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2010年版附錄VD測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9樣品雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本法適用于左卡尼汀片中右卡尼汀手性雜質(zhì)檢查，三批樣品中雜質(zhì)含量均在0.1%以下，遠(yuǎn)低于限度1.0%。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證：專屬性及系統(tǒng)適用性、重復(fù)性、線性關(guān)系與范圍、回收率、檢測(cè)限及定量限及耐用性等試驗(yàn)考察，該方法可行。首次對(duì)左卡尼汀片中的雜質(zhì)右旋卡尼汀含量測(cè)定進(jìn)行了方法確立與可行性研究。

采用柱前衍生法在phenomenex LUX Cellulose-1手性色譜柱上進(jìn)行分析，建立測(cè)定L-肉堿中D-肉堿含量的測(cè)定方法。該手性高效液相色譜法分離與分析對(duì)映異構(gòu)體具有快速、簡(jiǎn)單、高靈敏度等特點(diǎn)，對(duì)L-肉堿、D-肉堿具有良好的分離與分析效果，可用于L-肉堿類原料藥、保健品等樣品中D-肉堿的含量檢測(cè)。

本研究在參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[18]，改進(jìn)了檢測(cè)方法，肉堿對(duì)映體化學(xué)反應(yīng)主要發(fā)生在酯鍵或羥基，手性試劑常與肉堿結(jié)構(gòu)中的羥基反應(yīng)。采用衍生化方法用手性色譜柱分離左卡尼汀手性雜質(zhì)。該技術(shù)與衍生后用HPLC分析相比較，克服了實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜、重復(fù)性差的缺點(diǎn)。

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