一種簡便的皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法的建立及其培養(yǎng)結(jié)果分析

唐仕軍，趙冬，朱立倉，李曉天，朱文學(xué)，楊鵬，王業(yè)忠

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

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一種簡便的皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法的建立及其培養(yǎng)結(jié)果分析

唐仕軍1,2，趙冬1，朱立倉1，李曉天1,2，朱文學(xué)1,2，楊鵬1,2，王業(yè)忠1

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的建立一種簡便的皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，并鑒定其培養(yǎng)效果。方法取出生24 h內(nèi)的SD大鼠大腦皮層組織，采用胰酶消化法獲取神經(jīng)元細胞懸液，用10% FBS+DMEM高糖培養(yǎng)基接種在經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，4 h后全量換用Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺培養(yǎng)液。培養(yǎng)后采用倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)變化，連續(xù)觀察8天。神經(jīng)元培養(yǎng)7～8天進行免疫熒光染色，于激光共聚焦顯微鏡下對神經(jīng)元進行鑒定，計算神經(jīng)元密度和純度。結(jié)果皮層神經(jīng)元接種時體積小，透亮，呈圓形，單個散在分布。接種后有少量細胞開始貼壁，2 h左右貼壁較多，少量細胞伸出短小的突起；4 h左右已基本貼壁，大量細胞伸出突起，周圍光暈明顯；培養(yǎng)3天時神經(jīng)元突起明顯伸長，相互交織，細胞透亮，立體感強，呈圓形、橢圓形、梭形；培養(yǎng)5～6天時神經(jīng)元體積增大，突起交織成網(wǎng)狀；培養(yǎng)7～8天時，神經(jīng)元細胞體飽滿，細胞質(zhì)透亮，細胞核大而明顯，細胞體周圍折光性強，立體感好，突起交織成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。經(jīng)免疫熒光染色后鑒定，分離培養(yǎng)的是神經(jīng)元，密度1.5×106個/mL，純度>90%。結(jié)論成功建立了一種操作簡便的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法，該方法培養(yǎng)的神經(jīng)元純度高、密度大，可為今后的相關(guān)學(xué)科研究提供良好的細胞模型。

關(guān)鍵詞：皮層神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；Neurobasal；B27；細胞模型；新生大鼠

神經(jīng)元具有高度分化、很少分裂的特點，從神經(jīng)突起到成熟神經(jīng)組織分離出神經(jīng)元的過程中，神經(jīng)元會受到不同程度的損傷，因此神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)是一項對實驗要求較高、難度較大的培養(yǎng)技術(shù)。目前神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法很多，傳統(tǒng)方法取材于胎鼠，主要是因為胎鼠胚胎時期神經(jīng)元分化程度較低，體外生存能力強，取材中造成的不可逆損傷較小，便于成功培養(yǎng)；但胎鼠腦體積小，取材較為困難，且胎齡不易確定，故用新生鼠代替胎鼠進行原代培養(yǎng)已逐步被認可。出生24 h以內(nèi)的新生鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育基本完成，很多神經(jīng)元已長出突起，但是取材于該時期的腦組織對神經(jīng)元的損傷較大，神經(jīng)元死亡率較高，培養(yǎng)難度較大。2014年8月～2015年8月，我們在以往神經(jīng)元培養(yǎng)方法[1～5]的基礎(chǔ)上經(jīng)過反復(fù)試驗，對先前的培養(yǎng)方法加以改進，建立了一種簡便的神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法。現(xiàn)報告如下。

1材料

出生24 h內(nèi)的SD大鼠8只，雌雄不限，體質(zhì)量約7 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。DEME高糖培養(yǎng)基、10% FBS購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司，Neurobasal、B27、青霉素和鏈霉素(10 000 U/mL)、L-谷氨酰胺、0.25%胰酶購于美國GIBCO公司，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體購于英國ABCAM公司，L-多聚賴氨酸(PLL，1 mg/mL)、PBS購于上海生工生物工程有限公司。

2皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法

2.1培養(yǎng)基制備接種培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基+10% FBS+雙抗(青霉素和鏈霉素，100 U/mL)?；A(chǔ)培養(yǎng)基：Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺+雙抗(青霉素和鏈霉素，100 U/mL)，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2培養(yǎng)皿預(yù)處理細胞培養(yǎng)前2～3天，對細胞培養(yǎng)的所有器皿進行預(yù)處理：對手術(shù)器械及槍頭進行高壓蒸汽滅菌30 min后，烘箱烘干備用；玻璃蓋片先經(jīng)自來水沖洗干凈，烘箱烘干，再經(jīng)濃硫酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈；再用雙蒸水沖洗3遍，無水乙醇浸泡后，在超凈臺下酒精燈過火待全部乙醇蒸發(fā)。用尖鑷夾取玻璃蓋片放入6孔板內(nèi)，每孔1張，加入1～2 mL PLL，37 ℃細胞恒溫培養(yǎng)箱放置過夜。細胞培養(yǎng)前2 h，將6孔板內(nèi)的PLL吸盡，PBS沖洗3次，吸盡PBS，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)晾干備用。

2.3皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)取出生24 h內(nèi)的新生SD大鼠，在盛有75%乙醇的燒杯中清洗2次，每次1 min。在超凈臺下迅速斷頭取腦，置入預(yù)冷的玻璃皿中。左手持鑷固定新生鼠頭部，右手持眼科剪沿矢狀縫剪開顱骨，用一把長鑷剝除頭皮及顱骨，充分暴露大腦皮層。用眼科鑷在顯微鏡下小心剝離皮層的腦膜和血管，換用另一把眼科鑷小心取下皮層組織，移入到預(yù)先加入1 mL DMEM高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于冰上。用眼科剪將皮層組織剪成約1 mm×1 mm的組織碎塊，在培養(yǎng)皿中再加1 mL DMEM高糖培養(yǎng)基及2 mL 0.25%胰酶，在37 ℃細胞恒溫培養(yǎng)箱中消化。培養(yǎng)5 min時輕輕搖晃培養(yǎng)皿，15 min時取出培養(yǎng)皿，將組織塊吸入到提前預(yù)冷的離心管中，加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基2 mL終止消化。用1 mL進口槍頭輕輕吹打未完全消化的組織塊，待組織塊完全吹散后，將吹打后的細胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾，4 ℃離心(1 000 r/min)5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基2 mL重懸細胞。待細胞成為懸液后，取10 μL細胞懸液加入到90 μL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，充分混勻。再加入等量臺盼藍染色，置于計數(shù)板上，倒置相差顯微鏡下計算細胞密度，以≥1×106個/mL密度接種到提前包被有PLL的6孔板中，每孔加入2 mL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后用Neurobasal+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺培養(yǎng)液全量換液1次，以后每3天進行半量換液。

3皮層神經(jīng)元鑒定

3.1鏡下形態(tài)學(xué)觀察神經(jīng)元接種培養(yǎng)后，在倒置相差顯微鏡下觀察皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，連續(xù)觀察8天。皮層神經(jīng)元接種時體積小，透亮，呈圓形，單個散在分布。接種后有少量細胞開始貼壁，2 h左右貼壁較多，少量細胞伸出短小的突起；4 h左右已基本貼壁，大量細胞伸出突起，周圍光暈明顯。培養(yǎng)3天時神經(jīng)元突起明顯伸長，相互交織，細胞透亮，立體感強，呈圓形、橢圓形、梭形。培養(yǎng)5～6天時神經(jīng)元體積增大，突起交織成網(wǎng)狀。培養(yǎng)7～8天時，神經(jīng)元細胞體飽滿，細胞質(zhì)透亮，細胞核大而明顯，細胞體周圍折光性強，立體感好，突起交織成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。見插頁圖1。

3.2免疫熒光染色觀察神經(jīng)元培養(yǎng)7～8天，以抗NSE抗體為一抗，進行免疫熒光染色后對神經(jīng)元進行鑒定：0.01%預(yù)冷的PBS浸洗細胞爬片2次，吸盡PBS；4%多聚甲醛固定5 min，PBS浸洗2次，每次5 min。3%雙氧水封閉30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS浸洗3次，每次5 min。山羊血清封閉30 min，加入NSE 一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜(約12 h)，PBS浸洗3次，每次5 min；加入二抗。避光孵育60 min后PBS浸洗3次，每次5 min；滴加PI染液(1∶1 000)100 μL，30 s后PBS浸洗2次，每次2 min，甘油(約30 mL)封片。激光共聚焦顯微鏡下取6個視野拍照，觀察神經(jīng)元形態(tài)，計算神經(jīng)元密度；計數(shù)細胞總數(shù)，以熒光陽性細胞為神經(jīng)元，純度=神經(jīng)元數(shù)/細胞總數(shù)×100%。細胞經(jīng)NSE和PI免疫熒光雙標染色后呈強陽性，激光共聚焦顯微鏡下觀察，細胞質(zhì)和突起被染成綠色、胞核被染成紅色的為神經(jīng)元，細胞核被染成紅色而細胞質(zhì)無染色的為非神經(jīng)元，見插頁圖2。神經(jīng)元密度為1.5×106個/mL，純度>90%。

4討論

體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元為一種廣泛應(yīng)用的細胞模型，可為研究腦血管病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制及其治療提供試驗基礎(chǔ)[6～9]。本課題組通過反復(fù)的試驗，結(jié)合自身試驗條件及以往細胞培養(yǎng)方法，建立了一種操作簡單、細胞性質(zhì)穩(wěn)定、純度較高的皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法。現(xiàn)將經(jīng)驗總結(jié)如下。

4.1取材對象的選擇目前神經(jīng)元原代培養(yǎng)多采用新生鼠代替乳鼠，新生鼠的出生時間多選擇在24 h以內(nèi)，超過24 h的新生鼠皮層神經(jīng)元雖然可以培養(yǎng)成活，但其中神經(jīng)膠質(zhì)細胞含量較多，抑制神經(jīng)元的生長，甚至?xí)?dǎo)致神經(jīng)元死亡[10,11],故本研究選用出生12 h以內(nèi)的新生鼠，以提高神經(jīng)元原代培養(yǎng)的成活率。

4.2培養(yǎng)基的選擇神經(jīng)元培養(yǎng)基主要有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基兩種。用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基為神經(jīng)元提供生長所必需的營養(yǎng)成分，促進細胞的增殖。但神經(jīng)元培養(yǎng)基也能為神經(jīng)膠質(zhì)細胞提供豐富的營養(yǎng)，在細胞貼壁后神經(jīng)膠質(zhì)細胞開始分裂生長，到12 h時開始大量分裂，抑制神經(jīng)元生長。因此，在細胞接種時選擇含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，細胞接種后4 h時，神經(jīng)元已基本貼壁，換用神經(jīng)元專用培養(yǎng)基Neurobasal。Neurobasal可抑制非神經(jīng)元的增殖，使神經(jīng)元保持較好的細胞活性及生理特性[12,13],為神經(jīng)元提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。此外，Neurobasal中加入2% B27，可抑制膠質(zhì)細胞有絲分裂，促進神經(jīng)元的生長，使神經(jīng)元保持較好的活性，從而提高其純度。

4.3培養(yǎng)皿的處理神經(jīng)元較其他細胞難以在體外存活和生長。本課題組經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn)，當細胞接種到未經(jīng)PLL包被的培養(yǎng)皿后，細胞貼壁較慢，貼壁數(shù)量較少，大量細胞集聚成團懸浮在培養(yǎng)基中，且隨著時間的推移，懸浮細胞大量死亡。而使用經(jīng)PLL包被的培養(yǎng)皿，細胞接種后有少量細胞貼壁，2 h左右細胞貼壁較多，4 h左右已貼壁完全，神經(jīng)元生長良好。因此，細胞接種前需用PLL包被培養(yǎng)皿，促進神經(jīng)元的黏附及其貼壁生長。

4.4皮層神經(jīng)元的提取皮層神經(jīng)元的提取是培養(yǎng)成功的難點及關(guān)鍵步驟。首先要確保新生鼠是在出生24 h以內(nèi)；其次在暴露新生鼠大腦皮層時應(yīng)先用一把眼科鑷沿大腦邊緣由外向內(nèi)小心徹底地將腦膜和血管剝除，剝除腦膜和血管的過程中，注意保持大腦皮層的干凈和完整，然后換用另外一把無菌眼科鑷夾取大腦皮層表面一薄層，并迅速置入培養(yǎng)基中。取樣不可太厚，否則神經(jīng)膠質(zhì)細胞較多。整個過程中可將兩把眼科鑷置入預(yù)冷的DMEM高糖培養(yǎng)基中，一是為了清洗眼科鑷上殘留的組織，二是為了保持眼科鑷的潤滑度，便于提取皮層組織，提高細胞純度，減少雜質(zhì)。既往神經(jīng)元培養(yǎng)在取材時，斷頭取腦后多采用PBS或D-Hank′s將血反復(fù)漂洗干凈，然后再剝除皮膚及顱骨暴露雙側(cè)大腦半球，取出大腦半球置于顯微鏡下剝除腦膜和血管，其操作過程復(fù)雜，操作時間相對較長。本方法改進之處在于：①新生鼠經(jīng)酒精消毒后，迅速斷頭取腦，快速剪開顱骨、剝除顱骨及頭皮，充分暴露大腦皮層后，用兩把不同的眼科鑷分別取材，省去了漂洗的步驟，方法簡便易行，為后續(xù)操作節(jié)省了時間；②用于取材的兩把眼科鑷分別置于預(yù)冷的培養(yǎng)基中，其中一把用于剝除腦膜和血管，另一把用于夾取大腦皮層組織，既避免了雜質(zhì)污染，又便于皮層組織的提取，可進一步提高神經(jīng)元的純度。

4.5皮層組織消化將1 mL DMEM高糖培養(yǎng)基和2 mL 0.25%的胰酶混合，使胰酶稀釋比例為0.125%。將組織塊放入胰酶中進行消化，時間控制在15 min左右。5 min左右時晃動培養(yǎng)皿1次，使其充分混勻。若皮層組織較多，為使組織消化完全，可適當?shù)缺壤黾覦MEM高糖培養(yǎng)基和胰酶的用量。

4.6神經(jīng)元接種接種密度影響神經(jīng)元的生長。接種密度低時，神經(jīng)元分布稀疏，聯(lián)系減少，突觸伸展較慢，神經(jīng)元生長緩慢，而神經(jīng)膠質(zhì)細胞分裂明顯；接種密度大時，神經(jīng)元分布緊密，聯(lián)系增多，突觸增粗增長，相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可抑制非神經(jīng)元生長。本研究神經(jīng)元接種密度1×106個/mL。在細胞接種時，需將細胞懸液輕輕吹打，使神經(jīng)元成為單個的細胞。吹打過程中動作要輕柔，不能有氣泡，計數(shù)板計數(shù)后，均勻地接種在培養(yǎng)板中。接種后需按前后、左右、左上右下、右上左下方向搖勻細胞，細胞接種不均勻會使神經(jīng)元成堆集中在培養(yǎng)板中央，細胞貼壁后由于擁擠致細胞大量死亡。

4.7B27的應(yīng)用B27含有神經(jīng)元生長所必需的多種生長因子和微量元素，一方面可以保證神經(jīng)元生長所需的營養(yǎng)，另一方面可抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的增殖，以提高神經(jīng)元的純度[14,15]。

總之，本研究建立的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法操作簡便，其培養(yǎng)的神經(jīng)元純度高、密度大，可為今后的相關(guān)研究提供良好的細胞模型。

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胎牛血清(FBS)三磷酸腺苷(ATP)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 人類免疫缺陷病毒(HIV) 獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)

甲型肝炎病毒(HAV) 乙型肝炎病毒(HBV) 丙型肝炎病毒(HCV)

甘油三酯(TG) 總膽固醇(TC) 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)

高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 核因子-κB(NF-κB) 磷酸鹽緩沖液(PBS)

Establishment of a simple and convenient method for primary culture of cortical neurons

and identification of culture results

TANGShi-jun1,ZHAODong,ZHULi-cang,LIXiao-tian,ZHUWen-xue,YANGPeng,WANGYe-zhong

(1TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege,Shihezi832000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a simple and convenient method for primary culture and to identify its validity. MethodsThe cortical tissues of SD rats born within 24 h were collected, and we got the neuronal cell suspension by trypsin digestion, explanted onto poly-L-lysine-coated plates with DMEM +HG + 10% FBS culture medium for 4 h, then the medium was replaced with neuronal culture medium with Neurobasal 2% B27+0.5 mmol/L glutamine. We observed the neuronal morphological changes for 8 days through inverted phase contrast microscope. Under the laser scanning confocal microscopy, neurons were cultured for 7 to 8 days, and the cells were identified by immunofluorescence staining. The density and purity of neurons were calculated. ResultsWhen the cortex neurons were inoculated, they were small, bright, translucent, round, and scattered in the distribution. After inoculation, a small amount of cells adhered to the wall, 2 hours later, more cells adhered to the wall, and a few cells produced short neurites; 4 hours later, most cells adhered to the wall, and a large number of cells produced neurites around the halo. After 3 days of cluture, the neurites were elongated, intertwined, transparent, and had strong three-dimensional sense with the round, oval and fusiform shapes. After 5 to 6 days, the cell bodies of the neurons increased, and the processes of the neurons wove into a network. After 7 to 8 days, the body of neuronal cell was full, cytoplasm was translucent, nucleus was large and obvious, the cell body had strong refraction, three-dimensional sense was good, and the processes wove into a network structure. The neuron density was 1.5×106/mL and the purity was more than 90%. ConclusionA simple and convenient method for primary culture was established with high purity and high density, which can provide a good cell model for the related scientific research.

Key words:neurons; primary culture; Neurobasal; B27; cell model; newborn rats

收稿日期：(2015-10-13)

中圖分類號：R329.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)48-0019-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.006

通信作者簡介：王業(yè)忠(1967-)，男，主任醫(yī)師，研究方向為腦血管疾病及顱內(nèi)腫瘤等。E-mail: wangyz2008@126.com

作者簡介：第一唐仕軍(1987-)，男，碩士，研究方向為腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床。E-mail: 396112963@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81360185)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團博士基金資助項目(2011BB016)。