植物MicroRNA研究進展

鄭海澤，張紅芳

(山西省農業(yè)科學院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

植物MicroRNA研究進展

鄭海澤，張紅芳

(山西省農業(yè)科學院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

MicroRNA，簡稱miRNA，是一類長度約為22個核苷酸的內源單鏈非編碼小分子RNA，在生物發(fā)育過程中起著重要作用。筆者詳細介紹了植物miRNA的發(fā)現與形成過程，包括轉錄、加工成熟及功能復合體裝配3個主要步驟。分析了miRNA在植物生長發(fā)育、脅迫適應及自身形成途徑三方面的調控作用。

植物MicroRNA;MicroRNA的形成;調控機制

MicroRNA，簡稱miRNA，是一類長度約為22個核苷酸(nucleotide，nt)的內源單鏈非編碼小分子RNA［1］.1993年，Lee等［2］在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現了第1個能階段性調控胚胎后期發(fā)育的內源性小分子 RNA-lin-4，揭開了miRNA研究的序幕。7 a后，Reinhart等［3］在線蟲中又發(fā)現了第2個調控時序性發(fā)育的小分子RNA-let-7.lin-4和let-7長度都約為22 nt，作用時間也是暫時性的。所以，當時被命名為小分子時序 RNA (small temporal RNA，stRNA).2001年，來自美、德等國的3個不同研究小組通過大規(guī)模的克隆和功能研究，發(fā)現生物體內存在著大量類似的小分子RNA，并將它們統一命名為miRNA［4-6］.在最新的miRBase登記的miRNA數據庫中，人類、小鼠、擬南芥和水稻分別含有985，767，215和452種miRNA.

miRNA等調控小分子RNA的發(fā)現，使人們對RNA調控基因表達的功能有了全新的認識。這類調控小RNA在生物體內以嶄新的層面控制著基因表達過程，在發(fā)育、細胞增殖、凋亡、抵御環(huán)境脅迫等諸多方面發(fā)揮重要作用［7］。從目前所積累的實驗證據可以肯定，miRNA等小分子RNA涉及到了整個細胞水平的幾乎所有事件。

1 植物miRNA的形成過程

miRNA并不是由基因組直接轉錄出來，它在生物體內的產生是一個逐步的過程，包括轉錄、加工成熟及功能復合體裝配3個主要步驟。

1.1 miRNA初級轉錄本的形成

通常位于蛋白編碼基因間區(qū)域的植物內源miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄產生含有莖環(huán)結構的miRNA初級轉錄本(pri-miRNA)。

1.2 miRNA加工

DCL1(一種RNaseⅢ家族的Dicer同源物)在細胞核內切割pri-miRNA莖環(huán)結構中遠離或靠近環(huán)端的雙鏈位點，釋放出大小約為70 bp～300 bp的miRNA前體(pre-miRNA)。此過程還需要雙鏈RNA結合蛋白HYPONASTIC LEAVES 1(HYL1)和C2H2鋅指蛋白SERRATE(SE)的協助，它們在細胞核的加工中心D-body中與DCL1相互作用，共同行使功能［8］。隨后DCL1在細胞核內對pre-miRNA進行第2步切割，形成1個具有不完全配對的小分子雙鏈RNA復合體。此復合體既包含了成熟的miRNA鏈，也包含了源于pre-miRNA且與成熟miRNA配對的反義鏈，稱為miRNA*鏈［7］。

1.3 miRNA功能復合體裝配

miRNA:miRNA*互補雙鏈在甲基轉移酶Hua Enhancer 1(HEN1)的作用下3'末端的核苷酸甲基化［9］，同時在Exportin-5的同源物HASTY(HST)的作用下運出細胞核，轉移到RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中。RISC復合體蛋白中含有Argonaute(AGO)和RNA解旋酶，miRNA:miRNA*互補雙鏈中的一條單鏈可以選擇性結合到RISC上成為成熟miRNA，而另一條單鏈則被立即降解。

2 植物miRNA的作用機制

miRNA通過對靶mRNA直接切割或者翻譯抑制這兩種作用機制來負調控靶基因的表達。理想的植物miRNA靶標與miRNA之間互補錯配數一般不超過3個，且第10，11位堿基不允許有錯配，因為切點的位置恰好位于該位置之間。靶mRNA被miRNA介導切割之后，其較為穩(wěn)定的3'切割產物可以通過5'-RACE的方法得到，從而精確定位mRNA的切割位點。

最近的研究表明，植物miRNA不僅能切割靶mRNA，也能抑制翻譯。最早發(fā)現的典型個例是擬南芥的miR172，它與靶標基因APETALA2(AP2)的作用位點位于該基因編碼區(qū)，除有1個堿基的差異外，其它堿基完全互補。但在擬南芥花的發(fā)育過程中，miR172介導對靶基因的翻譯抑制，而不是直接切割調控［6］。miR172并不是植物miRNA中的一個特例，近來Voinnet研究小組通過遺傳學手段篩選出擬南芥中一系列miRNA活性缺陷(miRNA-action deficient，mad)突變體，發(fā)現大多數miRNA都具有切割靶標和翻譯抑制兩種作用機制，并且切割與抑制機制是協同進行的。對靶mRNA進行Northern雜交分析，大多數情況下既能檢測到未被切割的靶mRNA，也能檢測到較小的切割產物，表明植物miRNA一方面可以切割靶標，另一方面可以對于未被切割的靶mRNA進行翻譯抑制，最終的蛋白水平抑制效果是兩種作用的綜合，解釋了為什么以前發(fā)現miRNA對靶標蛋白水平抑制效果要高于轉錄水平［9］。miRNA和靶標的作用位點無論是在編碼區(qū)，還是在3'或5'UTR區(qū)，似乎并不影響靶標切割和翻譯抑制這兩種相互作用的強弱。

3 植物miRNA的生理功能

3.1 調控植物生長發(fā)育

對植物miRNA在生長發(fā)育過程中的調控作用已有大量深入的研究報道，這是因為相當一部分miRNA的靶標是在植物生長發(fā)育或細胞分化過程中起重要作用的轉錄因子。如，miR165/166通過調節(jié)3個同型亮氨酸拉鏈結構域(homeodomain leucine zipper，HD-Zip)轉錄因子PHB/PHV/REV的表達，決定葉子近軸與離軸細胞的分化方向。如果這3個基因與miR165/166的作用區(qū)域發(fā)生突變從而逃脫miR165/166的調控，那么突變體植株葉的極性會出現缺陷。研究人員通過正向遺傳學的方法在擬南芥中找到了編碼miR319的JAW基因，該基因突變的植株在葉片形狀和曲率方面都極不均勻，表明miR319可以通過降解TCP類轉錄因子家族的mRNA來調控擬南芥葉子的生長發(fā)育［10］。miR164的靶標是NAC類轉錄因子家族，包括CUC1和CUC2等，在miR164表達受到抑制的突變體中，花瓣的數量較野生型明顯增多，提示miR164通過調節(jié)轉錄因子CUC1和CUC2等的表達水平來控制花瓣的數量。最近的研究發(fā)現，miR164還能調控與植物葉片衰老相關的轉錄因子ORE1，過表達miR164的轉基因擬南芥植株葉片衰老過程被明顯延緩［13］?？梢哉f，植物miRNA幾乎參與調控植物所有重要的發(fā)育過程，包括葉的發(fā)育、器官極性、花的形態(tài)建成、開花時間、auxin信號傳導等。

3.2 調控植物適應環(huán)境脅迫

1)適應營養(yǎng)缺乏環(huán)境。在土壤或者含2 mM SO42-培養(yǎng)基中生長的擬南芥中，miR395的表達水平很低，用Northern雜交幾乎檢測不到。而當培養(yǎng)基中SO42-濃度從0.2 mM降低到0.02 mM時，miR395的表達量迅速升高，導致了靶基因APS量的降低。由于APS編碼ATP硫酸化酶，用來催化無機硫酸鹽消化的第一步反應，在低硫酸鹽環(huán)境中它的表達被miR395所下調，體現了植物對低硫酸鹽環(huán)境的適應［14］。另外一個類似的例子是擬南芥的miR399，它在正常生長環(huán)境下幾乎不表達，而在缺乏無機磷酸鹽環(huán)境中受到誘導，引起靶基因UBC表達量下降。UBC編碼一個泛素結合酶，它能夠使磷轉運蛋白AtPT1泛素化而降解。因此，UBC表達量下降會導致AtPT1的增加，從而有利于植物積累更多的磷酸鹽來應對磷元素缺乏。

2)應對氧化脅迫。擬南芥miR398的靶標是2個CSD基因，均編碼銅/鋅超氧化物歧化酶，能將超氧陰離子轉化成過氧化氫(H2O2)，在清除活性氧(ROS)自由基過程中起關鍵作用［11-12］。擬南芥植株在高強度光照、重金屬和甲基木精等氧化脅迫處理條件下，miR398的表達受到抑制，而CSD的表達明顯上升。過量表達miR398抗性形式的CSD基因能使轉基因植株提高對于氧化脅迫的耐受性。

3)其它非生物脅迫方面。低溫、干旱、高鹽［7］、紫外輻射［8］和機械損傷［15］等脅迫條件都會引起植物體內多種miRNA表達量的變化，暗示miRNA可能參與多種非生物脅迫的應答。

4)生物脅迫方面。擬南芥的miR393能通過負調控靶基因TIR1，AFB(均為auxin受體)表達，從而抑制auxin信號通路介導植株抗細菌抗性，過表達miR393能提高植株抵御細菌生長的能力。

植物miRNA還參與了自身形成途徑的調控。在植物體內，miRNA的表達必須受到精確的調控。因為細微的表達量差異也可能會引起一系列連鎖反應，從而改變植物的生理狀態(tài)。因此，在植物miRNA的形成過程中，每一個過程都會受到嚴格的調控，比如，miRNA基因的轉錄、DCL1的加工、RISC中的裝配等等。研究發(fā)現，植物miRNA形成過程中2個關鍵的基因DCL1和AGO1分別受到miR162和miR168的調控。DCL1參與了 miR162的產生，miR162則介導了DCL1的反饋調節(jié);AGO1能穩(wěn)定miR168，miR168與 AGO1結合后又能切割 AGO1 mRNA.miR162/DCL1和miR168/AGO1這種相互緊密調節(jié)方式確保了它們在體內處于動態(tài)平衡［9］。

4 展望

miRNA的發(fā)現，是RNA研究領域的重要突破，為人們提供了一種全新的視角來認識生物基因和基因表達調節(jié)的本質。在利用傳統方法研究基因時，注意力不能再僅僅局限在蛋白質和基因上面，對植物miRNA調控基因的錯綜復雜網絡目前有了一定的認識。就闡明miRNA與基因調控網絡來說，還需進一步詳細的了解。隨著研究的深入，miRNA將在生命起源和早期進化、基因復雜性等發(fā)育過程中產生更為重要的影響，將人類對自然的認識提高到新的高度。

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Research Progress on MicroRNA in Plants

Zheng Haize，Zhang Hongfang
(Wheat Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Linfen 041000，China)

MicroRNA(miRNA)is small RNA of 22 nucleotides(nt)in length that play important roles in regulating gene expression and biological processes.This review tried to have a brief introduction on the progresses of miRNA discovery and formation，including three steps of transcription，assemble processing and function complex processing.Regulating effect of miRNA in growth and development，stress adaption，its formation ways was analyzed.

MicroRNA in plant;MicroRNA formation;Regulatory mechanism

Q943

A

1007-726X(2015)03-0037-03

2015-07-01

山西省科技攻關項目(20150311001-5)

鄭海澤(1964— )，男，山西襄汾人，1986年畢業(yè)于山西農業(yè)大學，副研究員。