豬流感的檢測與診斷

豬流感的檢測與診斷

成大勇 （內(nèi)蒙古赤峰市家畜改良工作站 024031） 翁善鋼（外高橋出入境檢疫局 上海 浦東）

豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)是豬常見的病原體之一。SIV為正粘病毒科甲型流感病毒屬成員。各種年齡、性別和品種的豬均能感染，母豬群中檢測出甲型流感病毒陽性的概率相對較高。臨床上往往表現(xiàn)為急性呼吸道疾病，主要癥狀有發(fā)熱，厭食，體重減輕，嗜睡，咳嗽，呼吸困難，鼻和眼有分泌物排出。母豬會出現(xiàn)繁殖障礙和流產(chǎn)。此外，感染流感病毒之后還會繼發(fā)細(xì)菌性感染。豬流感發(fā)病率高，恢復(fù)緩慢，阻礙增重，降低料肉比，直接影響豬群健康狀態(tài)和質(zhì)量，是規(guī)模化養(yǎng)豬場普遍存在且難以根除的豬群發(fā)性疾病之一，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。自1918年首次報道豬流感以來，迄今為止，世界各大洲均有豬流感的發(fā)生和流行。迄今已發(fā)現(xiàn)的甲型SIV有HINl、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等11種不同亞型。豬群中流行的SIV亞型主要有H1N1、H3N2和H1N2三

種。其中，H1N1病毒于1930年在美國首次分離出來。2009年3月在墨西哥、美國等地暴發(fā)的甲型H1N1流感病毒，是一種新型的變異病毒株，這種新型流感病毒具有病毒雜交特性，它包含人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒的基因片段，同時擁有亞洲豬流感和非洲豬流感病毒特征。因此，豬流感不僅給畜禽養(yǎng)殖造成重大經(jīng)濟損失，而且還對人類健康造成威脅，因此快速、敏感、準(zhǔn)確診斷豬流感，具有重要的經(jīng)濟價值和公共衛(wèi)生意義。作為一種重要的人畜共患病，目前已有多種檢測和診斷方法用于SIV感染。

1 檢測樣品的采集

（1）用于直接檢測的樣品需要在SIV復(fù)制和向外排毒期間采集。通常是感染SIV后的1～8d?？贵w反應(yīng)通常在感染的7～21d后能夠檢測到。一般在感染后2～4周后采集血清樣品用于檢測抗體。樣品應(yīng)在采集后的48h內(nèi)送至實驗室進(jìn)行診斷。（2）采集豬的唾液以及鼻腔分泌物樣品對檢測豬流感病毒十分有用。由于唾液收集相對容易，對唾液樣本的檢測已成為重要的診斷篩查方法。唾液樣本的采集可以采用滅菌的棉簽，采集過程中避免有外來污染，如飼料，糞便和有機物質(zhì)。（3）唾液樣品可能很難從新生仔豬中采集。斷乳仔豬，生長豬以及成年豬采集唾液樣本比較容易。唾液樣品的缺點是可能會存在影響RT-PCR檢測的抑制劑。此外，樣品中病毒含量較低有可能會影響到測序或病毒分離。鼻試子樣品用于測序或病毒分離由于唾液樣品，因為其樣品中的病毒含量較高。

2 病理學(xué)診斷

對因SIV感染而死亡的豬進(jìn)行病理學(xué)診斷是一種重要的方法。病理學(xué)觀察所需的樣品包括使用福爾馬林固定的新鮮肺組織、氣管以及肺灌洗液。流感病毒感染的肺組織通常呈紫紅色。病理學(xué)觀察可以看到肺部的呼吸道(支氣管或細(xì)支氣管)上皮壞死。肉眼或顯微鏡下觀察到病變加上RT-PCR檢測呈陽性可以用作流感的確診。

3 實驗室診斷

3.1 電鏡技術(shù) 通過電鏡能夠觀察到病毒粒子。SIV病毒粒子呈橢圓形，棒狀和圓形，直徑約為80～120nm。雖然電鏡技術(shù)直接、客觀，但是對病毒滴度不僅要求高，設(shè)備昂貴，而且需要熟練的技術(shù)操作人員，因此，電鏡用于臨床檢測的價值較低。

3.2 病毒分離和鑒定 從待檢病料樣品中分離和培養(yǎng)SIV在檢測宿主范圍和致病機理的研究及疫苗生產(chǎn)等方面都很重要。豬流感病毒可在雞胚和培養(yǎng)細(xì)胞中增殖，由于雞胚中增殖敏感性高，通常被稱為豬流感診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是病毒分離出來之后，還需要多種方法進(jìn)一步鑒定確診。

3.3 血清學(xué)診斷 常規(guī)SIV的亞型鑒定最實用的確診方法是血清學(xué)診斷技術(shù)，即紅細(xì)胞凝集(HA)試驗、血凝抑制(HI)試驗、神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)試驗、中和試驗(SN)、瓊脂凝膠擴散試驗(AGID)、免疫熒光法(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(IPMA)、免疫組織化學(xué)(IHC)試驗。這些傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法往往操作繁瑣，診斷時間長，結(jié)果重復(fù)性不好，限制了傳統(tǒng)方法在實際中的應(yīng)用。例如IHC是一種可用于診斷豬流感的檢測方法，但需要將臟器組織使用福爾馬林進(jìn)行固定。IHC方法主要用于鑒定肺臟上的流感病毒抗原。但是福爾馬林固定以及臟器的選擇會影響到檢測的特異性和敏感性。

3.4 分子生物學(xué)診斷 傳統(tǒng)診斷方法在病毒的初次分離和亞型鑒定中仍然起著重要的作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)行豬流感快速診斷和鑒定已成為國內(nèi)外研究豬流感的重要手段之一。分子診斷技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、針對性強、診斷快速等優(yōu)點。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)是實驗室檢測常用的分子生物學(xué)方法。檢測的樣品可以是唾液、鼻分泌物和肺組織等。RT-PCR可用來鑒定分離的病毒，也可直

接用于臨床病料的檢測，因此，RT-PCR能對SIV作出早期診斷。隨著RT-PC技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已經(jīng)能夠用于檢測不同流感病毒的亞型，即確定感染的病原是H1N1、H1N2、H3N2或其他亞型的流感病毒。實時熒光定量RTPCR的方法用于SIV的檢測也早有報道。

除此之外，其他的一些分子生物學(xué)診斷方法如依賴核酸序列的擴增法、核酸探針、基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、內(nèi)源性病毒編碼酶檢測法等也都有用于SIV檢測的報道。這些技術(shù)在用于SIV方面各有特點和優(yōu)勢。例如，利用基因芯片技術(shù)能夠用來檢測1-16亞型的甲型流感病毒，并且還可以對當(dāng)前流行的甲型H1N1流感病毒進(jìn)行特異性檢測，還可以對H1，H3，H5，H7，H9亞型流感病毒進(jìn)行分型檢測。

總之，隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，將SIV的傳統(tǒng)診斷方法和現(xiàn)代的分子生物學(xué)診斷新技術(shù)有效地結(jié)合起來，不斷改進(jìn)診斷方法和技術(shù)，這肯定能夠為防控豬流感提供必要的技術(shù)保障。

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2015–05–23）