神經(jīng)肽Y對(duì)原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元NMDA受體電流的影響及其機(jī)制探討

李琦軍，張淑麗，常軍英，白玉娟，穆衛(wèi)盧，賈東昭，王彥志，李炎

(1石家莊市第三醫(yī)院，石家莊050011;2秦皇島市骨科醫(yī)院)

生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫監(jiān)視功能，當(dāng)其受到刺激后，IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子大量釋放，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷［1，2］，其作用機(jī)理可能與激活 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體有關(guān)［3，4］。NMDA 受體本身是一種離子通道蛋白，其被激活后，離子通道開(kāi)放，Ca2+、Na+、K+等陽(yáng)離子進(jìn)入細(xì)胞，尤其是Ca2+大量?jī)?nèi)流。離子的跨膜流動(dòng)形成 NMDA受體電流(INMDA)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷［5～7］。神經(jīng)肽 Y(NPY)通過(guò)作用于其 Y1受體，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活和IL-1β、TNF-α表達(dá)，減輕神經(jīng)元損傷。2012年6月～2014年3月，本研究觀察了NPY對(duì)原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元INMDA的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生24 h內(nèi)SD大鼠60只，雌雄不限，清潔級(jí);河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(冀)2013-1-03。脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司)，NPY Y1受體阻斷劑 BIBP3226(美國(guó)Tocris Bioscience公司)，NPY(美國(guó) ENZO公司)。三維操縱器、電極拉制器(美國(guó) Sutter instruments company公司)，700B型膜片鉗放大器(美國(guó)Axon公司)。

1.2 原代大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及處理 取新生24 h內(nèi)SD大鼠30只，無(wú)菌環(huán)境下開(kāi)顱取大腦皮質(zhì)，參照Nakajima等［8］方法進(jìn)行原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色，證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞純度＞95%，滿足實(shí)驗(yàn)需要。將純化好的小膠質(zhì)細(xì)胞以1×105/mL接種于預(yù)鋪多聚賴氨酸的6孔板內(nèi)，3 mL/孔。培養(yǎng)3 d后換新鮮無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步化。將細(xì)胞分為1、2、3、4組，每組5孔。1組以無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育6 h;2組以含終濃度為100 ng/mL LPS的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育6 h;3組先以含NPY(1 μmol/L)的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5 h，然后加入LPS(100 ng/mL)繼續(xù)孵育6 h;4組先用含BIBP3226(1 μmol/L)的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5 h，再加入 NPY(1 μmol/L)孵育 0.5 h，最后加入LPS(100 ng/mL)繼續(xù)孵育6 h。

1.3 原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)及處理 取新生24 h內(nèi)SD大鼠30只，無(wú)菌環(huán)境下開(kāi)顱取大腦皮質(zhì)，參照Yang等［9］方法進(jìn)行原代神經(jīng)元培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)熒光染色，證實(shí)神經(jīng)元純度＞95%，滿足實(shí)驗(yàn)需要。將純化好的神經(jīng)元分為1、2、3、4組，每組5孔，分別加入相對(duì)應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育神經(jīng)元6 h。小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液、神經(jīng)元培養(yǎng)液體積比為1∶1。

1.4 神經(jīng)元INMDA檢測(cè) 混合培養(yǎng)液孵育神經(jīng)元6 h后，采用標(biāo)準(zhǔn)全膜片鉗技術(shù)記錄神經(jīng)元將各組神經(jīng)元爬片取出，置于0.3 mL浴槽，采用細(xì)胞外液(2 mL/min)持續(xù)灌流細(xì)胞，保證液體交換在2 min內(nèi)完成。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，選擇輪廓清晰、立體感強(qiáng)、表面光滑的5個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行封接實(shí)驗(yàn)。三維操縱器阻抗為1～3 MΩ。將灌充電極內(nèi)液的玻璃微電極與細(xì)胞表面形成封接，加大負(fù)壓至吸破細(xì)胞，補(bǔ)償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞記錄。設(shè)置鉗制電壓為-60 mV。形成全細(xì)胞模式后穩(wěn)定5 min，至細(xì)胞內(nèi)液和電極內(nèi)液完全置換。細(xì)胞外給予100 μmol/L NMDA 和10 μmol/L甘氨酸誘發(fā)電流發(fā)生內(nèi)向型變化，此電流即INMDA。計(jì)算INMDA峰值電流的電流密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)性和方差齊性要求的數(shù)據(jù)，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1、2 、3、4 組INMDA峰值電流密度分別為(23.19 ±1.29)、(38.91 ±3.29)、(27.09 ±2.58)、(35.56 ±3.92)Pa/Pf;與1組相比，2組電流密度增強(qiáng)(P＜0.05);與2組相比，3組電流密度降低(P＜0.05);與3組比較，4組電流密度上升(P＜0.05)。

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)行使免疫監(jiān)視和防御功能，是腦內(nèi)重要的免疫細(xì)胞。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)可從分支狀變成圓形或阿米巴狀，細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)也隨之增高，釋放各種生物活性物質(zhì)。這些生物活性物質(zhì)大量產(chǎn)生并積聚于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。LPS是由氨基甙組成的磷脂，是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的組成成分之一。LPS對(duì)神經(jīng)元無(wú)明顯影響，但對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞有很強(qiáng)的激活作用。LPS激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)生成多種生物活性物質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡。

NMDA是外源性NMDA受體選擇性激動(dòng)劑，與NMDA受體結(jié)合后，使細(xì)胞膜去極化，開(kāi)放相應(yīng)離子通道。甘氨酸是NMDA受體復(fù)合體的正性變構(gòu)調(diào)制物。在甘氨酸存在的情況下，NMDA對(duì)NMDA受體的激活效應(yīng)大大增加。因此，本研究中采用NMDA和甘氨酸共同作用，以激活NMDA受體。將各組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液和神經(jīng)元培養(yǎng)液1∶1混合后孵育神經(jīng)元，既保證了神經(jīng)元細(xì)胞成活需要的各種營(yíng)養(yǎng)成分，又能保持膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中物質(zhì)與神經(jīng)元的有效接觸。膜片鉗技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，含LPS的培養(yǎng)液孵育小膠質(zhì)細(xì)胞后，再用此培養(yǎng)液孵育神經(jīng)元，神經(jīng)元INMDA較1組增強(qiáng);提示小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起神經(jīng)元INMDA增強(qiáng)，被LPS活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)非直接接觸途徑增加神經(jīng)元INMDA。提前在膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入NPY，能夠明顯抑制LPS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，其培養(yǎng)液孵育的神經(jīng)元INMDA增強(qiáng)幅度明顯下降;說(shuō)明NPY能夠通過(guò)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制神經(jīng)元INMDA過(guò)度增強(qiáng)。再加入NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226，NPY的上述作用消失;說(shuō)明NPY通過(guò)激活其Y1受體來(lái)抑制神經(jīng)元INMDA過(guò)度增高。但上述結(jié)果還需進(jìn)一步研究以證實(shí)。

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