高濃度葡萄糖體外對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制探討

曲虹，厲泉(山東省千佛山醫(yī)院，濟(jì)南250014)

高濃度葡萄糖體外對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制探討

曲虹，厲泉
(山東省千佛山醫(yī)院，濟(jì)南250014)

摘要:目的觀察高濃度葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活性的影響，探討其作用機(jī)制。方法體外傳代培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，隨機(jī)分為N、G15、G25、G35組，分別給予DMEM培養(yǎng)基及含15、25、35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d。采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞光密度值( OD值，代表細(xì)胞活性)，采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色、免疫熒光( FITC標(biāo)記)染色及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子1α( HIF-1α)和促紅細(xì)胞生成素( EPO)蛋白。結(jié)果N、G15、G25、G35組細(xì)胞OD值分別為0.83±0.02、0.55±0.02、0.45±0.02、0.33±0.02，組間比較，P均＜0.01。N組未見HIF-1α、EPO陽(yáng)性細(xì)胞，G15、G25、G35組可見黃染的HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞及呈綠色熒光的EPO陽(yáng)性細(xì)胞。N、G15、G25、G35組HIF-1α蛋白OD值分別為0.02±0.01、0.58±0.02、0.75±0.02、0.92±0.02，組間比較，P均＜0.01; EPO蛋白OD值分別為0.03±0.01、0.48±0.02、0.33±0.02、0.25±0.02，組間比較，P均＜0.01。結(jié)論高濃度葡萄糖可降低體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞HIF-1α、EPO蛋白表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞:糖尿病視網(wǎng)膜病變;視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞;葡萄糖;低氧誘導(dǎo)因子1α;促紅細(xì)胞生成素

Effect of high glucose on cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and the mechanism

QU Hong，LI Quan
( Qianfoshan Hospital of Shandong Province，Jinan 250014，China)

Abstract:Objective To observe the effect of high glucose on the cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and to investigate the mechanism.Methods Rats'retinal Müller cells of serial subcultivation were divided into N，G15，G25，and G35groups which were cultured by DMEM medium or DMEM medium containing 15 mmol/L，25 mmol/L and 35 mmol/L glucose for five days，respectively.MTT assay was applied to detect the optical density ( OD value which represents the cell viability) in all groups.The expression of hypoxia-inducible factor-1α( HIF-1α) and erythropoietin ( EPO) was detected by immunochemistry，immunofluorescence and enzyme linked immunosorbent assay.Results The OD values of the N，G15，G25and G35groups were respectively 0.83±0.02，0.55±0.02，0.45±0.02 and 0.33±0.02，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).There were no positive cells of HIF-1α and EPO in the N group.Cells presented yellow positive expression of HIF-1α by immunochemistry and green fluorescence positive expression of EPO by immunofluorescence in the G15，G25and G35groups.The OD values of HIF-1α protein were respectively 0.02±0.01，0.58±0.02，0.75±0.02 and 0.92±0.02 in the N，G15，G25and G35groups，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).The OD values of EPO in the N，G15，G25and G35groups were respectively 0.03±0.01，0.48±0.02，0.33±0.02 and 0.25±0.02，and significant difference was found among these four groups ( all P＜0.01).Conclusion High glucose may decrease the cell viability of rat retinal Müller cells cultured in vitro and increase the expression of HIF-1α and EPO which may be one of its mechanisms.

Key words:diabetic retinopathy; retinal Müller cells; glucose; hypoxia inducible factor-1α; erythropoietin

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，高濃度葡萄糖引起的視網(wǎng)膜微血管改變和神經(jīng)細(xì)胞凋亡是其主要發(fā)生機(jī)制。Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)維持視網(wǎng)膜完整和正常功能等具有重要作用［1］。但是，高濃度葡萄糖對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響及其與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的關(guān)系，目前尚不清楚。2011年12月～2014 年12月，本研究觀察高濃度葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活性的影響，探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料出生5～7 d的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)Wistar乳鼠40只，雌雄不限，由青島市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(美國(guó)Gibco公司)，D-葡萄糖、促紅細(xì)胞生成素( EPO) (美國(guó)Sigma公司)，抗鼠低氧誘導(dǎo)因子1α( HIF-1α)、EPO單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，WIP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)公司)，PV6001免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒和FITC標(biāo)記二抗(北京中山生物技術(shù)公司)。

1.2視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞傳代培養(yǎng)及分組將Wistar乳鼠酒精浸泡處死，剝離視網(wǎng)膜，經(jīng)胰蛋白酶、乙二胺四乙酸消化后，過(guò)篩網(wǎng)、離心、棄上清，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于多聚賴氨酸包被的25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后第1次換液，之后每3 d換液1次，培養(yǎng)7～10 d時(shí)細(xì)胞融合達(dá)80%，以1∶2方式進(jìn)行傳代。每天用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程及形態(tài)學(xué)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)谷氨酰胺合成酶( GS)表達(dá)，以鑒定視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，取第3代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象［2］。顯微鏡觀察到第3代細(xì)胞胞體大、扁平，胞核清晰、核仁明顯，胞質(zhì)豐富，可見粗大突起，呈鑲嵌樣排列，細(xì)胞分界不清; GS陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)95%以上;滿足實(shí)驗(yàn)要求。將上述培養(yǎng)細(xì)胞隨機(jī)分為N、G15、G25、G35組，分別給予DMEM培養(yǎng)基及含15、25、35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞活性檢測(cè)各組培養(yǎng)5 d后，接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL，常規(guī)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白調(diào)零孔。培養(yǎng)液沖洗后每孔加入100 μL MTT溶液( 0.5 mg/mL)，室溫下孵育4 h后，翻板棄去MTT溶液，每孔加200 μL二甲基亞砜，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔光密度值( OD 值)。OD值越高代表細(xì)胞活性越強(qiáng)。

1.4細(xì)胞HIF-1α、EPO檢測(cè)①各組以每孔2× 104個(gè)/mL的密度接種于孔內(nèi)預(yù)置1 cm2蓋玻片的24孔板中，處理5 d后終止培養(yǎng)，吸出培養(yǎng)液，PBS沖洗、多聚甲醛固定，取出蓋玻片置于載玻片上，羊血清封閉10 min，甩去多余液體，不洗。采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)HIF-1α( 1∶100)，倒置顯微鏡下觀察和照相;采用細(xì)胞免疫熒光( FITC標(biāo)記)染色檢測(cè)EPO( 1∶100)，熒光顯微鏡下觀察和照相。②采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HIF-1α、EPO蛋白。各組培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入WIP細(xì)胞裂解液500 μL提取蛋白，調(diào)整各組蛋白質(zhì)濃度為5 μg/mL;接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔，酶標(biāo)儀檢測(cè)495 nm波長(zhǎng)處各孔OD值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，多組樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞活性比較N、G15、G25、G35組細(xì)胞OD值分別為0.83±0.02、0.55±0.02、0.45± 0.02、0.33±0.02，組間比較，P均＜0.01。

2.2各組細(xì)胞HIF-1α、EPO蛋白表達(dá)比較①N組未見HIF-1α、EPO陽(yáng)性細(xì)胞，G15、G25、G35組可見黃染的HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞及呈綠色熒光的EPO陽(yáng)性細(xì)胞。②N、G15、G25、G35組HIF-1α蛋白OD值分別為0.02±0.01、0.58±0.02、0.75±0.02、0.92± 0.02，組間比較，P均＜0.01; EPO蛋白OD值分別為0.03±0.01、0.48±0.02、0.33±0.02、0.25± 0.02，組間比較，P均＜0.01。

3　討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病嚴(yán)重危害視力的眼部并發(fā)癥之一，其發(fā)病與糖尿病病程有一定關(guān)系，持續(xù)的高糖、缺氧、缺血是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生、發(fā)展的刺激因素［3］。研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境不僅引起微血管的改變，還可引起神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、光感受器細(xì)胞等視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷、變性、凋亡，最終導(dǎo)致視力的喪失［4］。Müller細(xì)胞是一種膠質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)成視網(wǎng)膜內(nèi)精細(xì)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)［5］。Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜正常的生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，如營(yíng)養(yǎng)和支持視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，參與“血-視網(wǎng)膜屏障”的形成，傳遞神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)［6］。此外，Müller細(xì)胞還參與多種視網(wǎng)膜病理過(guò)程，在缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變的神經(jīng)損傷及再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7］。由于Müller細(xì)胞對(duì)維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)具有重要作用，所以保持Müller細(xì)胞正常生理功能狀態(tài)對(duì)整個(gè)視網(wǎng)膜功能的維持具有重要意義［8］。本

研究選用15、25、35 mmol/L這3個(gè)高糖干預(yù)濃度，觀察不同濃度高糖對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G15、G25、G35組細(xì)胞活性明顯低于N組，提示這3個(gè)高糖濃度均會(huì)引起Müller細(xì)胞的損傷; G35組細(xì)胞活性低于G25組，G25組細(xì)胞活性低于G15組，提示Müller細(xì)胞高糖損傷程度與葡萄糖濃度呈正相關(guān)。

心、腦等重要組織存在一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，細(xì)胞感受低氧刺激可改變有關(guān)基因的表達(dá)，以提高細(xì)胞對(duì)損傷的耐受力［9］。低氧可提高細(xì)胞HIF-1α及其下游基因的表達(dá)，這些基因可使細(xì)胞防御功能增強(qiáng)，保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步的損傷，上述基因被稱為低氧相關(guān)基因，包括HIF-1以及HIF-1下游的EPO和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等靶基因［10］。本研究結(jié)果顯示，N組未見HIF-1α和EPO蛋白陽(yáng)性表達(dá)，而G15、G25、G35組均可見HIF-1α和EPO蛋白陽(yáng)性表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白表達(dá)隨葡萄糖濃度升高而增加; EPO蛋白在15 mmol/L葡萄糖濃度時(shí)表達(dá)明顯增加，之后隨著葡萄糖濃度升高而下降。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成，其中HIF-1α起活性作用［11］。正常氧狀態(tài)下，細(xì)胞不斷合成HIF-1α蛋白，又迅速被酶降解系統(tǒng)降解，所以N組無(wú)法檢測(cè)到HIF-1α蛋白表達(dá)［12］。HIF-1 DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性雖受到氧分壓嚴(yán)格調(diào)節(jié)，但是HIF-1可以被多種細(xì)胞外刺激活化，無(wú)論缺氧或非缺氧情況，氧自由基和非自由基氧活性物質(zhì)均可參與HIF-1活性的調(diào)節(jié)［13］。氧化應(yīng)激水平的增高與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，這可能與高糖狀態(tài)下糖代謝、脂代謝紊亂導(dǎo)致自由基生成增加，而清除系統(tǒng)明顯受損有關(guān)［14］。HIF-1α是雙重作用因子，在一定條件下可產(chǎn)生抗凋亡等保護(hù)作用，但是超過(guò)一定的量，就會(huì)發(fā)揮促凋亡和促新生血管的作用［15］。本研究中15 mmol/L葡萄糖作用于細(xì)胞時(shí)，刺激Müller細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)源性自我保護(hù)機(jī)制，HIF-1α表達(dá)增加并誘導(dǎo)下游基因EPO表達(dá)增加;但當(dāng)葡萄糖濃度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，細(xì)胞功能下降，盡管HIF-1α表達(dá)繼續(xù)增加，但EPO蛋白表達(dá)下降，此時(shí)HIF-1α可能發(fā)揮促凋亡和促新生血管生成的作用。

總之，高濃度葡萄糖可導(dǎo)致體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞HIF-1α、EPO蛋白表達(dá)增加可能是其損傷機(jī)制之一，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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收稿日期:( 2015-04-20)

通信作者簡(jiǎn)介:厲泉( 1973-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樾难芗膊　-mail: liquann@163.com

作者簡(jiǎn)介:第一曲虹( 1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)椴Ａw視網(wǎng)膜病變。E-mail: qh1009@126.com

基金項(xiàng)目:山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( ZR2011HL057; ZR2013HM028)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 28-0015-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R587.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.005