下調(diào)ATAD2表達對胃癌細胞增殖的影響及其機制探討

楊薇，徐梅梅，夏鳳宇，姜東春，劉紅利

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000)

下調(diào)ATAD2表達對胃癌細胞增殖的影響及其機制探討

楊薇，徐梅梅，夏鳳宇，姜東春，劉紅利

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000)

目的 觀察下調(diào)三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)表達對胃癌細胞增殖的影響，并探討其作用機制。方法 將過表達ATAD2胃癌細胞株MGC-803分為4組，A、B、C組分別給予siRNA1、siRNA2、Neg. siRNA轉(zhuǎn)染48 h，D組不轉(zhuǎn)染。采用流式細胞儀檢測MGC-803細胞周期，Western blot法檢測ATAD2蛋白及細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4、Rb。結(jié)果 與C、D組比較，A、B組G0/G1期細胞比例升高(P均<0.01)，S期細胞比例降低(P均<0.05)，細胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4表達減少，但不引起Rb的表達變化。結(jié)論 下調(diào)ATAD2表達能夠抑制胃癌細胞增殖、細胞周期進展，其作用機制與降低Cyclin D1、CDK4等細胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白表達有關(guān)。

胃腫瘤；三磷酸腺苷酶家族蛋白2；細胞增殖；細胞周期相關(guān)蛋白

三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)具有AAA區(qū)域和溴區(qū)結(jié)構(gòu)域[1]，AAA區(qū)域作為分子伴侶，執(zhí)行裝配、操作、分解蛋白復(fù)合物的功能；溴區(qū)結(jié)構(gòu)域參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其表達異常導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展[2]。2012年1月～2013年12月，我們觀察了下調(diào)ATAD2表達對胃癌細胞增殖的影響，并探討其作用機制，為胃癌的基因治療尋求新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 過表ATAD2胃癌細胞株MGC-803購自上海細胞庫，置于37 ℃、5% CO2下RPMI 1640培養(yǎng)基和10%特級胎牛血清中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與轉(zhuǎn)染 將細胞以6×104接種24孔板后分為4組，次日A、B、C組分別給予siRNA1、siRNA2、Neg. siRNA 1 μL(20 μmol/L)+HiperFect轉(zhuǎn)染試劑3 μL轉(zhuǎn)染48 h，D組不轉(zhuǎn)染。siRNA1(5′-GGAUCUCUCUUCAAUUAAUTTAUUAAUUGAAGAG-AGAUCCTT-3′)、siRNA2(5′-GUGCGUCGAAGUUGU-AGGATTUCCUACAACUUCGACGCACTT-3′)、Neg.si-RNA(sense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，anti-sense：ACGUGACACGUUCGGAGAATT)序列由上海吉瑪公司進行合成。

1.2.2 細胞周期檢測 將細胞消化離心，收集細胞沉淀；800 r/min離心8 min， PBS洗滌細胞2次；調(diào)整細胞濃度為8×104/mL，制備1 mL細胞懸液；去除懸液上清，加入75%預(yù)冷乙醇1 mL，混勻后4 ℃過夜；次日離心，PBS洗滌3次，加入100 μL的RNase A 37 ℃水浴20 min并加入400 μL的PI，室溫避光20 min；上流式細胞儀檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細胞周期相關(guān)蛋白檢測 Western blot法檢測細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4及Rb的表達，按試劑盒說明操作，以目的蛋白與β-actin光密度比值表示各蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞周期比較 見表1。

注：與C、D組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 各組細胞周期相關(guān)蛋白表達比較 見表2。下調(diào)ATAD2表達可以降低Cyclin D1和CDK4表達，但不引起Rb的表達變化。見圖1。

3 討論

注：與C、D組比較，*P<0.05，#P<0.05。

細胞周期是調(diào)控細胞生長增殖的最終途徑，在調(diào)控細胞生長增殖中起重要作用。各因素通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，介導(dǎo)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過細胞周期變化來實現(xiàn)細胞生長增殖改變。細胞周期分為G0、G1、S、G2和M這5個不同的時期[3]。在整個細胞周期中存在多個細胞周期檢測點，其中G1/S、G2/M是控制細胞周期進展最重要的兩個檢測點[4]。機體正常細胞通過細胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子相互作用，精確調(diào)控各檢測位點，維持細胞動態(tài)平衡、保持細胞正常代謝；然而腫瘤細胞中的細胞周期關(guān)鍵檢測點，被不同信號通路作用調(diào)控，改變細胞正常增殖狀態(tài)[5]。Cyclins和CDKs是正向調(diào)控細胞周期進展的兩類關(guān)鍵分子。在外界因素驅(qū)動下，兩者可形成異源二聚體，通過磷酸化作用，以Cyclins為調(diào)節(jié)亞基，CDKs為催化亞基，促進細胞周期由G1期向S期進展。目前，CDK1-CDK4是已被證實的能夠直接參與調(diào)控細胞周期的細胞因子[6]。在外界信號的刺激下，Cyclin D與CDK4結(jié)合形成具有活性的異源二聚體，活化E2F轉(zhuǎn)錄因子，進而激活Cyclin A、Cyclin E、DNA聚合酶等多個基因的轉(zhuǎn)錄表達，促進細胞周期由G1期向S期進展。

ATAD2是新近發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄因子，是C-Myc、雄激素受體和ER-a的輔助因子，并受雌雄激素的控制[7，8]。目前，關(guān)于ATAD2影響腫瘤細胞增殖及細胞周期的分子機制還不清楚。有研究表明，ATAD2與C-Myc形成共表達復(fù)合物，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，對腫瘤增殖的起重要的驅(qū)動作用[9]。在乳腺癌中，ATAD2在乳腺癌中通過控制B-Myb和EZH2促進細胞的增殖。在前列腺、宮頸癌、惡性膠質(zhì)瘤、骨肉瘤和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中[10,11]。ATAD2通過與C-Myc、E2F等轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，增強了腫瘤中與增殖、抗凋亡等相關(guān)基因的表達。在肝癌中，RNA測序結(jié)果顯示ATAD2基因中發(fā)現(xiàn)新的外顯子—外顯子連接復(fù)合體，呈現(xiàn)過表達[12]。本研究顯示，下調(diào)ATAD2表達可增加G1期細胞比例，降低Cyclin D1和CDK4表達。這提示ATAD2在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演促癌基因的角色，為胃癌的基因治療提供了潛在的治療靶點。但是，目前對于ATAD2在胃癌中的作用機制還不甚了解，沒有明確的通路研究，今后我們將會進一步研究ATAD2影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，為胃癌的診斷、預(yù)后判斷等提供新的參考依據(jù)。

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