小鼠Sca-1陽性心臟內(nèi)源性干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增及標(biāo)記物觀察

劉平平，李文靜，常芬，趙靜，井慶川( 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院，山東煙臺64000;山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院; 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所)

小鼠Sca-1陽性心臟內(nèi)源性干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增及標(biāo)記物觀察

劉平平1，李文靜2，常芬2，趙靜2，井慶川3
( 1濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院，山東煙臺264000;2山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院; 3山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所)

摘要:目的分離、擴(kuò)增干細(xì)胞抗原1( Sca-1)陽性心臟內(nèi)源性干細(xì)胞，并觀察其標(biāo)記物情況。方法取C57BL/6小鼠心肌組織，用磁珠分選法分離Sca-1陽性內(nèi)源性心臟干細(xì)胞，并對其傳代擴(kuò)增。觀察初分離及傳代過程中細(xì)胞形態(tài)的變化，用流式細(xì)胞儀檢測初分離及擴(kuò)增后(第5代) Sca-1陽性心臟干細(xì)胞陽性率，以RT-PCR法檢測Sca-1陽性及陰性心臟干細(xì)胞肌球蛋白重鏈6( MYH6)、肌鈣蛋白T( cTnT)、心肌轉(zhuǎn)錄因子4( GATA4)標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)果初分離的Sca-1陽性心臟干細(xì)胞為圓形，比血細(xì)胞小;傳代后細(xì)胞呈現(xiàn)星形，伸出較長的偽足，第5代后形狀差異不大。原代、第5代心肌細(xì)胞Sca-1陽性心臟干細(xì)胞陽性率分別為81.0%±10.4%、90.0%±5.0%，P ＞0.05; Sca-1陽性心臟干細(xì)胞MYH6、cTnT、GATA4相對表達(dá)量分別為0.50±0.21、0.72±0.04、0.72±0.05，陰性心臟干細(xì)胞分別為0.20±0.02、0.86±0.06、0.71±0.05，兩者M(jìn)YH6、cTnT比較，P均＜0.05。結(jié)論成功分離出Sca-1陽性心臟干細(xì)胞，且傳代穩(wěn)定、純度較高，高表達(dá)MYH6。

關(guān)鍵詞:心臟干細(xì)胞;肌球蛋白重鏈6;肌鈣蛋白T;心肌轉(zhuǎn)錄因子4;磁珠分選法

Isolation，amplification and marker observation of Sca-1 positive cardiac stem cells in mice

LIU Ping-ping1，LI Wen-jing，CHANG Fen，ZHAO Jing，JING Qing-chuan
( 1Yantai Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Yantai 264000，China)

Abstract:Objective To isolate and amplify the Sca-1 positive cardiac stem cells from C57BL/6 mice in vitro and to observe its markers.Methods The myocardial tissues from C57BL/6 mice were selected，and we separated the Sca-1 positive cells by the magnetic cell sorting and amplified its passage.We observed the morphology changes in the culture process.The flow cytometry was used to test the Sca-1+purity of the primary and fifth generation of myocardial cells.RTPCR was used to detect the expression of multiple factors ( MYH6，cTnT and GATA4) in the isolated Sca-1 positive cells and negative cells.Results The primary cultured Sca-1 positive cells were round，smaller than blood cells; the sub-cultured were starlike，and the pseudopodia were long，and after the fifth generation，the morphology of cells showed little difference.The Sca-1+positive rates of primary and the fifth generation were 81%±10.4% and 90%±5%，separately ( P＞0.05).The relative expression of MYH6，cTnT and GATA4 in Sca-1+cells was 0.5±0.21，0.72±0.04 and 0.72 ±0.05，separately; while the expression in the Sca-1－cells was 0.2±0.02，0.86±0.06 and 0.71±0.05.Significant difference was found in the expression of MYH6 and cTnT ( all P＜0.05).Conclusion Sca-1 positive cardiac stem cells can be isolated successfully and sub-cultured stablely.Furthermore，Sca-1+cells show high expression of MYH6.

Key words:cardiac stem cells; myosin heavy chain 6; troponin T; myocardial transcription factor 4; magnetic cell sorting

研究認(rèn)為，心肌細(xì)胞數(shù)量減少是缺血性心臟病患者死亡的主要病理學(xué)因素［1］。干細(xì)胞移植是治療缺血性心臟病的有效途徑，內(nèi)源性心臟干細(xì)胞被認(rèn)為是修復(fù)損傷心肌最合適的干細(xì)胞類型［2］。Sca-1陽性心臟干細(xì)胞即是一種內(nèi)源性心臟干細(xì)胞，可在成體心臟中分離。研究發(fā)現(xiàn)，將該細(xì)胞移植到小鼠心臟梗死周邊區(qū)后，可分化為心肌細(xì)胞，促進(jìn)周圍血管新生，改善左心室功能［3］。因此，分離并獲

取高純度、足夠數(shù)量的Sca-1陽性細(xì)胞十分關(guān)鍵。2014年1月～2015年6月，我們以C57BL/6小鼠為標(biāo)本，分離、擴(kuò)增Sca-1陽性心臟內(nèi)源性干細(xì)胞，并觀察其標(biāo)記物情況。

1　材料與方法

1.1材料10周齡C57BL/6小鼠12只，雌雄不限，體質(zhì)量25～30 g，由山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，于25℃恒溫、無菌飼養(yǎng)。膠原酶、胰酶干粉、EDTA、牛血清白蛋白(上海生工)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，磁珠、Sca-1抗體(美國BD公司) ;培養(yǎng)皿、CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)，血球計數(shù)板(鹽城市恒泰玻璃儀器廠) ; TS 100倒置相差顯微鏡(日本Nikon)，冷凍高速離心機(jī)(德國Sigma公司)，DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀(北京市六一儀器廠)，F(xiàn)A1204B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)，BLOCK HEATERS(海門市其林貝爾儀器有限公司)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)，磁力架( Promega公司)。

1.2 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)將小鼠斷頸處死，迅速取出心臟，清洗，剪碎至1 mm3大小。37℃下以0.01%胰酶及0.1%膠原酶混合液消化30 min，加入500 μL胎牛血清終止消化，200目細(xì)胞篩過濾。將濾液350 g離心8 min，用細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，使其密度達(dá)2×107/mL。向溶液中加入生物素標(biāo)記的Sca-1抗體，每1×107個細(xì)胞加5 μL，冰上孵育20 min。用1×BD buffer洗滌標(biāo)記的細(xì)胞，350 g離心8 min，除去未結(jié)合的抗體。每1×107個細(xì)胞加25 μL親和鏈霉素標(biāo)記的磁珠，混勻，4℃孵育45 min。用1×BD buffer洗滌細(xì)胞，至細(xì)胞濃度為( 20～80)×106/mL。將盛有細(xì)胞的EP管放置到磁力架上，Sca-1陽性心臟干細(xì)胞會通過結(jié)合的Sca-1抗體結(jié)合到磁珠上，從而被吸附到EP管管壁。吸出上清，再次加入1×BD buffer，重復(fù)細(xì)胞吸附這一步驟4次，以得到較純的Sca-1陽性心臟干細(xì)胞。最后一次吸附完成后，用加入含10 μg/mL生長因子和10%胎牛血清的IMDM 1 mL，懸浮Sca-1陽性心臟干細(xì)胞;并將其移入24孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞長滿24孔板后吸走廢液，10 mL PBS洗滌2次。每孔加入0.1 mL胰酶。倒置顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞變圓時，吸走胰酶，加入新的IMDM培養(yǎng)液，混勻吹打質(zhì)細(xì)胞懸浮。把細(xì)胞分至新的培養(yǎng)皿中，放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞形態(tài)觀察將原代、傳代Sca-1陽性心肌干細(xì)胞分別接種于24孔板中，待細(xì)胞長滿后將其均勻轉(zhuǎn)入小皿中，用含有生長因子和10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)，換液1次/3 d，培養(yǎng)2～3周后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。1.4.2 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞傳代穩(wěn)定性觀察分別取心肌的原代、第5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液( 1× 106/mL)，300 g離心5 min去除廢液;用cell staining buffer重懸細(xì)胞，加入PE-Cy5-CD45抗體，F(xiàn)ITC-Sca-1陽性抗體，PE-CD34抗體冰上染色30 min; 300 g離心5 min，PBS洗2次;最后再次加入cell staining buffer重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測，Devove軟件計算原代、第5代Sca-1陽性心臟干細(xì)胞陽性率。

1.4.3 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞標(biāo)記物觀察分別取Sca-1陽性、陰性心臟干細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測細(xì)胞標(biāo)記物，包括肌球蛋白重鏈6( MYH6)、肌鈣蛋白T( cTnT)、心肌轉(zhuǎn)錄因子4( GATA4)。標(biāo)記物引物序列均參考文獻(xiàn)［4］設(shè)計合成，檢測均按使用說明書進(jìn)行。以β-actin作為內(nèi)參，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度比值作為標(biāo)記物相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，數(shù)據(jù)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞形態(tài)初分離的Sca-1陽性心臟干細(xì)胞形態(tài)為未貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞為圓形，比血細(xì)胞小。分離后第3天Sca-1陽性心臟干細(xì)胞開始貼壁，第7天長到皿底面積的40%，約2周長滿后可正常傳代培養(yǎng)。以后3～4 d傳代1次。貼壁后細(xì)胞呈現(xiàn)星形，伸出較長的偽足。第5次傳代后形狀差異不大。

2.2 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞傳代穩(wěn)定性原代、第5代心肌細(xì)胞Sca-1陽性心臟干細(xì)胞陽性率分為別81.0%±10.4%、90.0%±4.5%，P＞0.05。

2.3 Sca-1陽性心臟干細(xì)胞的標(biāo)記物Sca-1陽性心臟干細(xì)胞MYH6、cTnT、GATA4相對表達(dá)量分別為0.50±0.21、0.72±0.04、0.72±0.05，陰性心臟干細(xì)胞分別為0.20±0.02、0.86±0.06、0.71± 0.05，兩者M(jìn)YH6、cTnT比較，P均＜0.05。

3　討論

以往研究認(rèn)為，成年哺乳動物的心臟是靜止不變的器官，心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等心臟的組成部分均在出生后即停止克隆增殖、分化，心臟損傷后不能完全修復(fù)再生。但近年來這一觀點(diǎn)受到了很大挑戰(zhàn)。2002年，Hierlihy等［5］從小鼠心臟分離出具有干細(xì)

胞活性的維拉帕米敏感的心臟邊緣群細(xì)胞，與新生心肌細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)可使其分化為心肌細(xì)胞，首次證實(shí)了心臟內(nèi)源性再生機(jī)制。Beltrami等［6］證實(shí)，成年小鼠的心臟中存在可自我更新、克隆及多潛能分化的心肌細(xì)胞，推測心臟中存在心臟干細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，心臟干細(xì)胞主要聚集于心房及房室交界處，在適宜刺激條件下可分化形成心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等［7，8］。根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志，可以將心臟干細(xì)胞分為c-kit陽性細(xì)胞、側(cè)群細(xì)胞、Islet-1陽性心肌祖細(xì)胞、Sca-1陽性心臟干細(xì)胞。c-kit+心臟干細(xì)胞是最早發(fā)現(xiàn)的心臟干細(xì)胞，臨床研究較早但其分離、純化、擴(kuò)增非常困難，限制了其臨床應(yīng)用范圍;而SP心臟干細(xì)胞的獲取周期較長，體外研究較困難［9］。

Sca-1是Ly-6家族的成員之一，最早被作為造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記物［10］。最近許多報道表明骨髓、骨骼肌及胚胎干細(xì)胞中都有Sca-1陽性多能干細(xì)胞，能分化為肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及骨骼肌、平滑肌細(xì)胞，表明Sca-1陽性在體細(xì)胞分化中起重要作用［11，12］。Sca-1陽性心臟干細(xì)胞是心臟中所占比例最高的一種干細(xì)胞，它可以向內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化［13］。研究發(fā)現(xiàn)，Sca-1基因敲除可阻止心臟干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，將Sca-1陽性心臟干細(xì)胞注射到缺血再灌注動物模型中，可觀察到其分化為心肌細(xì)胞，使心臟泵血能力改善［14］。

既往文獻(xiàn)報道干細(xì)胞分離、純化及擴(kuò)增方法偏少，初分離的心臟干細(xì)胞數(shù)量少，傳代后心臟干細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定，Sca-1陽性心臟干細(xì)胞陽性率與剛分離的干細(xì)胞相比有顯著差異，而且實(shí)驗(yàn)重復(fù)成功率低。本研究為Sca-1陽性心臟干細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)。且5代以內(nèi)干細(xì)胞性質(zhì)穩(wěn)定，和原代細(xì)胞相比沒有顯著差異。

GATA4是心肌分化早期的標(biāo)志性基因，MYH6、cTnT是成熟心肌細(xì)胞的標(biāo)志性基因。由于Sca-1陽性心臟干細(xì)胞能夠分化為心肌細(xì)胞［15，4］，我們對這幾個基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。PCR結(jié)果表明，Sca-1陽性心臟干細(xì)胞高表達(dá)MYH6，可能是Sca-1陽性干細(xì)胞更容易分化為心肌細(xì)胞的主要原因。Sca-1基因如何促進(jìn)了MYH6的高表達(dá)還有待進(jìn)一步研究，但是MYH6可以作為鑒定Sca-1陽性干細(xì)胞的輔助指標(biāo)。

綜上所述，采用磁珠分選法體分離、純化及擴(kuò)增的Sca-1陽性心臟干細(xì)胞，具有培養(yǎng)操作過程簡單、重復(fù)成功率高、多次傳代細(xì)胞特性穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

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收稿日期:( 2015-06-01)

通信作者簡介:井慶川( 1975-)，男，副研究員，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)。E-mail: zhaojingqch@163.com

作者簡介:第一劉平平( 1977-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楣谛牟〗槿爰盎A(chǔ)。E-mail: ppl300@126.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目( 31371158)。

文章編號:1002-266X( 2015) 30-0014-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R541

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.005