血清miRNA對(duì)中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)意義*

劉俊峰 莫秀梅 孟威威 陳達(dá)燦

廣東省中醫(yī)院(廣州 520120)

·學(xué)術(shù)探討·

血清miRNA對(duì)中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)意義*

劉俊峰 莫秀梅 孟威威△陳達(dá)燦▲

廣東省中醫(yī)院(廣州 520120)

目的：探討血清miRNA對(duì)中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)意義。方法：分析血清miRNA及中醫(yī)證的特點(diǎn)，miRNA表達(dá)的時(shí)序性和特異性與證候的動(dòng)態(tài)變化非常相似，將血清miRNA引入中醫(yī)藥辨證論值得研究領(lǐng)域關(guān)注，從而闡明中醫(yī)證候的實(shí)質(zhì)及科學(xué)內(nèi)涵。結(jié)論：血清miRNA可以作為微觀辨證的指標(biāo)與宏觀辨證相結(jié)合提高辯證的準(zhǔn)確性，也可為臨床個(gè)體化治療提供重要的指導(dǎo)作用。

miRNA是一類長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，通過堿基配對(duì)的方式結(jié)合到靶mRNA的3’端，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)，影響蛋白質(zhì)的合成，是一類十分重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。miRNA不但具有高度保守性、器官組織特異性，而且可以通過精確地調(diào)控靶基因的表達(dá)而參與細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過程。近年研究發(fā)現(xiàn)血液中的miRNA的異常表達(dá)與多種人類疾病密切相關(guān)，血清miRNA有可能成為疾病診斷、治療及預(yù)后判斷的新興分子生物標(biāo)志物。辨證論治是中醫(yī)認(rèn)識(shí)及治療疾病的最基本原則，也是最具特色的診斷和治療方法，本文主要探討血清中miRNA對(duì)辨證及治療的指導(dǎo)作用。

1 血清miRNA 血清miRNA有2種來(lái)源，一種是由凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞裂解過程中被動(dòng)滲漏產(chǎn)生的，通常發(fā)生在腫瘤增殖轉(zhuǎn)移或者慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，由于組織或者細(xì)胞破裂，miRNA則從細(xì)胞中被動(dòng)滲漏到血液[1]。另一種是由于細(xì)胞微囊泡主動(dòng)分泌產(chǎn)生的，微囊泡可能是運(yùn)輸循環(huán)中miRNA的主要載體，在細(xì)胞中miRNA首先被裝載入分泌囊泡之中，隨后伴隨微囊泡的分泌而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)之中；在細(xì)胞培養(yǎng)液和人體外周血液的微囊泡中都含有miRNA。盡管循環(huán)中miRNA的來(lái)源尚未完全闡明，循環(huán)血中miRNA是對(duì)某種疾病的病理生理過程主動(dòng)適應(yīng)的介質(zhì)，它們的變化可能在細(xì)胞通訊、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控免疫細(xì)胞功能等多個(gè)方面起著重要作用。也有報(bào)道血漿室溫放置24h或多次反復(fù)凍融，對(duì)血漿中miRNA分子幾乎無(wú)影檢測(cè)血清中miRNA不僅創(chuàng)傷小、方法簡(jiǎn)便，而且結(jié)果準(zhǔn)確較可靠，對(duì)于提高疾病診斷、分類及預(yù)后的精度有重要作用。miRNA已具備了疾病生物標(biāo)志物的特點(diǎn)。目前為止，血清miRNA表達(dá)譜的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成熟。因此，血清miRNA有望成為疾病診斷、治療和預(yù)后判斷的新興分子生物標(biāo)志物。

2 miRNA與中醫(yī)證之間的關(guān)系 證候研究是中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究的一個(gè)至關(guān)重要的科學(xué)問題。中醫(yī)的“證”是指在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有內(nèi)在聯(lián)系，且能夠反映疾病過程中某一特定階段的病理病機(jī)，也是機(jī)體對(duì)致病因素反應(yīng)的一種功能狀態(tài)。中醫(yī)證候包括證候病機(jī)和與其密切相關(guān)的癥候群兩個(gè)部分，具有抽象與具體的雙重特性，而且證候的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，蘊(yùn)涵著不同的層次、變量和時(shí)相性等多維特征，具有整體性、傳變性、時(shí)空性及個(gè)體差異性等特點(diǎn)?！坝兄T內(nèi)必形諸外”，證候體現(xiàn)了從分子、細(xì)胞及組織器官的動(dòng)態(tài)演變。隨著miRNA研究的不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA具有2大特征，首先，在不同組織、器官、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，miRNA 表達(dá)譜存在很大差異，揭示了 miRNA 的表達(dá)具有時(shí)序特異性與組織特異性；另外，每種 miRNA 有多個(gè)潛在靶基因；對(duì)于不同細(xì)胞或者同一細(xì)胞的不同狀態(tài)，某一特定 miRNA可調(diào)控的靶標(biāo)是不完全相同的，是動(dòng)態(tài)變化的，揭示了miRNA 的表達(dá)具有時(shí)空動(dòng)態(tài)變化的特性[2]。

中醫(yī)的“證”有即時(shí)性與差異性的特點(diǎn)，因?yàn)槠涫悄骋浑A段的情況，所以會(huì)處于不斷的動(dòng)態(tài)變化之中；miRNA具有精確特異的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，參與很多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，二者有相似的特性。miRNA及其表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化過程與臨床表現(xiàn)的癥狀和體征有內(nèi)在的聯(lián)系，其可能參與了證候的發(fā)生與動(dòng)態(tài)變化。

3 血清中miRNA在中醫(yī)證型研究中的應(yīng)用 目前，循環(huán)中的miRNA與中醫(yī)證型的研究還比較少，仍處于初步探索階段。Zhang[3]等研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝辨證為肝膽濕熱證和肝腎陰虛證患者的血清中miR-583、miR-663、miR-1299的量明顯高于正常對(duì)照組，而且肝膽濕熱證患者的血清中miR-583、miR-663的量明顯高于肝腎陰虛證組和正常對(duì)照組，由此可以推斷miR-583、miR-663可作為慢性乙肝不同證型的生物標(biāo)記物。Chen等[4]進(jìn)一步對(duì)慢性乙肝辨證屬肝膽濕熱證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證患者血清中的miRNA進(jìn)行分析，研究表明3種中醫(yī)證型患者血清中的miRNA表達(dá)譜明顯不同，隨后采用Pathway和GO功能分析研究表明慢性乙肝的3種證型分子機(jī)理也不相同，其中虛實(shí)夾雜證(肝郁脾虛證)與虛證(肝腎陰虛)本質(zhì)上并不是接近的，而且二者較實(shí)證(肝經(jīng)濕熱證)更加復(fù)雜，虛實(shí)夾雜證較虛證發(fā)展為癌癥進(jìn)程的風(fēng)險(xiǎn)更高，研究同時(shí)表明血清中部分miRNA可能是由實(shí)證轉(zhuǎn)化為虛證過程中的重要介質(zhì)。以上研究表明將宏觀辨證與微觀辨證結(jié)合起來(lái)探討證候的演變規(guī)律對(duì)中醫(yī)辨證有一定的指導(dǎo)意義。

馮知濤[5]等將類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者分為風(fēng)濕夾瘀型和肝腎虧虛型，研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕夾瘀型患者外周血miR-146a、miR-16水平高于肝腎虧虛型，紅細(xì)胞沉降率(ESA)及C反應(yīng)蛋白(CRP)也高于肝腎虧虛型，而類風(fēng)濕因子(RF)低于肝腎虧虛型。風(fēng)濕夾瘀型RA患者外周血miR-146a、miR-16的表達(dá)水平和ESR、CRP、RF等指標(biāo)可為RA患者的辨證分型提供客觀的參考。因此血清miRNA與疾病相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相結(jié)合可以作為中醫(yī)辨證過程中潛在的分子標(biāo)記物。

除了血液中的miRNA與中醫(yī)的證有關(guān)外，研究表明唾液中及腫瘤組織中的miRNA與中醫(yī)的證也有密切關(guān)系。SongGao[6]等研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者唾液中一些特異的miRNA與中醫(yī)證存在密切關(guān)系，結(jié)果顯示miR-17、miR-21、miR-181b在濕熱證中特異性表達(dá)，miR-196a在脾虛證中特異性表達(dá)，意味著miRNA在不同的證中發(fā)揮著不同的作用，這一研究在一定程度上也揭示miRNA可以作為中醫(yī)證的分子標(biāo)記物。李立平等[7]研究發(fā)現(xiàn)“脾胃濕熱型”患者胃癌組織miR-449相對(duì)表達(dá)量明顯低于其它證型，揭示了胃癌濕熱之邪與miRNA的相關(guān)性。

4 中醫(yī)藥對(duì)血液中miRNA水平的調(diào)控研究 Chao Jiang等[8]研究發(fā)現(xiàn)脾腎虧虛型重癥肌無(wú)力患者血清存在87個(gè)異常的miRNA表達(dá)譜，其中42個(gè)miRNA的表達(dá)高于正常對(duì)照組，45個(gè)miRNA低于正常對(duì)照組，采用中藥健肌寧治療后不但可以改善重癥肌無(wú)力患者癥狀，而且45個(gè)低水平的miRNA中有43個(gè)明顯上調(diào)，42個(gè)高水平miRNA中有35個(gè)出現(xiàn)下調(diào)，進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法對(duì)miRNA表達(dá)譜及靶基因分析，發(fā)現(xiàn)血清中17個(gè)miRNAs的變化以及一些免疫細(xì)胞凋亡通路的抑制作用是中藥健肌寧療效的部分作用機(jī)制。以上研究表明，中醫(yī)藥可通過直接或間接對(duì)miRNA的調(diào)控從而起到治療作用，進(jìn)一步對(duì)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)進(jìn)行分析，得到方劑起效的相關(guān)miRNA表達(dá)譜，進(jìn)而從miRNA水平揭示中醫(yī)藥治病的作用機(jī)制。

此外，有研究報(bào)道血清/血漿中miRNA還可反映肝臟損傷情況，用高濃度對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)小鼠肝損后發(fā)現(xiàn)血漿miR-22、miR-101b、miR-122及miR-192的表達(dá)與小鼠肝臟損傷呈時(shí)間及劑量依賴關(guān)系，而以血漿miR-122及miR-192作為分子標(biāo)志物比用肝臟酶學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)肝臟損傷更敏感[9]。

5 血清中miRNA對(duì)中醫(yī)辨證論治的指導(dǎo)意義

5.1 宏觀與微觀辨證結(jié)合，提高中醫(yī)辨證的準(zhǔn)確性 血清的清潔、無(wú)創(chuàng)、快速的特性使血清中miRNA在各類疾病生物標(biāo)記物研究中優(yōu)勢(shì)明顯。對(duì)中醫(yī)而言，證候是研究的瓶頸，目前研究發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證型患者血清miRNA的表達(dá)不同，對(duì)于中醫(yī)的辨證已經(jīng)出現(xiàn)整體與血清miRNA或者與其它實(shí)驗(yàn)室等微觀指標(biāo)相結(jié)合的系統(tǒng)性研究。微觀辨證可彌補(bǔ)宏觀辨證的不足，這種思路有助于辨證的客觀性和準(zhǔn)確性，從而指導(dǎo)臨床的處方用藥。此外，將血清miRNA引入中醫(yī)辨證論治的研究體系中，使用芯片技術(shù)及生物信息學(xué)，通過建立與證候有關(guān)的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，很有可能從轉(zhuǎn)錄后水平闡明 “中醫(yī)證”本質(zhì)的科學(xué)內(nèi)涵。

5.2 血清miRNA可作為中醫(yī)藥療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物 21世紀(jì)臨床醫(yī)學(xué)的特征是個(gè)體化醫(yī)療，其本質(zhì)就是基于生物標(biāo)志物的醫(yī)療選擇。對(duì)于一些具有異質(zhì)性的疾病而言，由于個(gè)體差異較大，不同的個(gè)體對(duì)于同一治療的反應(yīng)也不同，對(duì)于中醫(yī)藥治療療效確切的疾病，將患者血清miRNA或者與其它實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)結(jié)合作為療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物，在臨床過程中將患者分層，實(shí)施個(gè)體化治療，提高臨床療效的同時(shí)，做到科學(xué)、合理、安全的用藥。目前采用血清miRNA作為中醫(yī)藥療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物尚未見相關(guān)的研究報(bào)道，這也是以后的研究方向。明確中醫(yī)不同證型患者血清miRNA表達(dá)譜的不同以及中醫(yī)藥療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，可為最終實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。

[1] Zen K，Zhang CY. Circulating microRNAs：a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers[J].Med Res Rev，2012，32：326-348．

[2] 李 潔，秦性良，邵寧生.microRNA及其靶基因的時(shí)空特異性與動(dòng)態(tài)變化[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2013，40(7)：617-626.

[3] Hui Zhang，Yan Guan，Yi-Yu Lu，et al. circulating mir-583 and mir-663 refer to zheng differentiation in chronic hepatitis B[J]．Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume，2013：751341.

[4] Chen QL，Lu YY，Zhang GB，et al.Characteristic Analysis from Excessive to Deficient Syndromes in Hepatocarcinoma Underlying miRNA Array Data[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013：1-8.

[5] 馮知濤，李 娟，任 潔.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血miR-146a、miR-16的表達(dá)水平及臨床指標(biāo)與中醫(yī)證型的關(guān)系探討[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011，11 (11)：1226-1229.

[6] Gao S，Chen LY，Wang P，et al.MicroRNA Expression in Salivary Supernatant of Patients with Pancreatic Cancer and Its Relationship with ZHENG[J]. Biomed Res Int，2014：1-8.

[7] 李立平，吳煒景，邱 嫻，等.廣東地區(qū)胃癌患者中醫(yī)臨床證候分型與miR-449表達(dá)相關(guān)性研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(12)：2695-2698.

[8] Jiang C，Liu P，Zhang J ，et al.Clinical Study of Effects of Jian Ji Ning ，a Chinese Herbal Medicine Compound Preparation，in Treating Patients with Myasthenia Gravis via the Regulation of Differential MicroRNAs Expression in Serum[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014：1-14.

[9] Wang K，Zhang S，Marzolf B，et al.Circulating microRNAs，potentional biomarkers for drug-induced liver injury. [J] Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(11)：4402-7.

(收稿2015-02-03；修回2015-03-16)

*廣東省財(cái)政廳課題[粵財(cái)工(2013)]

△廣州中醫(yī)藥大學(xué)( 廣州 510405)

▲通訊作者

血清/診斷 miRNA 辨證論治

R242

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.065

廣東省中醫(yī)藥管理局課題(20142066)

廣東省中醫(yī)藥強(qiáng)省建設(shè)專項(xiàng)中醫(yī)優(yōu)勢(shì)病種突破項(xiàng)目[粵財(cái)社(2014953)]