紙片法藥敏試驗失敗的原因分析及解決措施

獸醫(yī)臨床常用的藥敏試驗方法主要有兩種，即擴散法和稀釋法。擴散法屬手工測試方法，通過測試藥物紙片或者牛津杯在固體培養(yǎng)基上的抑菌圈的大小，判斷細菌對該種藥物是否敏感。稀釋法包括試管稀釋法和微量稀釋法，通過測試細菌在含不同濃度藥物培養(yǎng)基內的生長情況，判斷其最低抑菌濃度（MIC）。由于擴散法操作簡單，成本低，已經被大多數獸醫(yī)臨床實驗室和基層單位所采用。擴散法又包括紙片法、牛津杯法和打孔法，目前獸醫(yī)臨床應用較多的方法是紙片法，以下針對該法進行分析。

一、問題的提出

按照標準操作程序進行操作，測量出抑菌圈大小，根據藥敏實驗標準進行判讀，獲得比較敏感的藥物，現場使用常常出現敏感藥物得不到良好的治療效果，或者藥敏實驗不敏感的藥物在現場使用卻能獲得較好的治療效果，這是很多從事獸醫(yī)實驗室工作的獸醫(yī)想不明白的，是不是藥敏試驗做錯了？還是藥物是假藥？又或者是藥敏試驗本身就不靠譜？一堆的問號讓獸醫(yī)工作者無所適從，那么究竟為何會有這樣的結果，有了這樣的結果如何改善？

二、問題分析

1.藥敏實驗步驟（紙片法）。（1）無菌采集合適的病料組織，無菌接種培養(yǎng)皿或者肉湯進行再置于37℃溫箱中培養(yǎng)16～24 h增菌。（2）在超凈工作臺中或酒精燈旁，用無菌棉簽或經酒精燈火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將菌液均勻涂布到平皿中的固體培養(yǎng)基表面。（3）用無菌鑷子將紙片（提前制備好）放于固體培養(yǎng)基表面并輕壓，使紙片與培養(yǎng)基表面完全接觸。為了能準確觀察結果，要求藥敏紙片均勻分布于培養(yǎng)基上，位置安排適中，防止出現抑制圈重疊。一般各紙片中心相距應大于24 mm，可在平皿中央貼一片，外周等距離貼5～6片。（4）標記每種藥敏紙片的名稱。（5）貼完紙片的平皿15 min后再置于37℃溫箱中培養(yǎng)16～24 h，觀察記錄結果。（6）結果判讀：以藥敏紙片周圍沒有肉眼可見生長物區(qū)域為抑菌圈，根據抑菌圈直徑大小判斷細菌對抗菌藥的敏感性。

2.影響藥敏試驗結果的因素。

（1）實驗本身因素。

培養(yǎng)基：①培養(yǎng)基的成分的不同，不僅影響敏感菌株的生長繁殖并可影響到抑制圈的直徑。一般細菌，如大腸桿菌及葡萄球菌可使用普通營養(yǎng)瓊脂；做磺胺類藥物敏感試驗時應選用無蛋白胨平板；鏈球菌和巴氏桿菌可用綿羊血瓊脂平板。②傾注平板時，厚度應合適（約5～6 mm），不可太薄，一般90 mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18～20 ml為宜。③培養(yǎng)基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。④市場提供的藥敏試驗的培養(yǎng)基缺乏嚴格質控，質量難以保證，建議采購質量過硬的產品或者自制培養(yǎng)基。

細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。市場售賣的藥敏紙片缺乏嚴格質控，質量難以保證，建議按要求自制藥敏紙片。

培養(yǎng)時間：一般細菌培養(yǎng)溫度和時間為37℃ 12～24 h，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好藥敏紙片的培養(yǎng)基先置4℃冰箱內2～4 h，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細菌的生長，而得到較明顯的抑菌圈。

（2）獸醫(yī)人員的因素。

操作的問題：①標準的藥敏試驗需要先進行細菌的分離培養(yǎng)，故藥敏試驗報告出結果時間長，檢驗與臨床缺乏溝通，對于基層獸醫(yī)站或養(yǎng)殖場，藥敏結果不能滿足臨床治療要求，容易延誤治療時機。目前常規(guī)基層獸醫(yī)實驗室都采用自創(chuàng)的簡便方法（無菌取病死畜禽的部分肝、脾等組織，按1∶5加生理鹽水研磨制成懸液，靜置5 min，用無菌吸管吸懸液，加兩滴于營養(yǎng)瓊脂板上，涂布均勻，5 min后貼上藥敏試紙，培養(yǎng)、觀察抑菌圈大?。?，這個方法可以快速獲得結果，但結果往往也出現誤差，原因一是細菌量較少，二是污染的問題很難排除，結果不一定是臨床細菌所致。②自制藥敏片無法保證每一片紙片所含藥物有效成分均一，導致結果出現誤差，建議采用牛津杯法進行實驗，用精密的移液槍可以量化每個牛津杯中的藥物含量。

對每種藥物的藥動學一知半解：在選擇高敏藥物時沒有考慮藥物的吸收途徑。藥敏試驗是藥液直接和細菌接觸，而在給畜禽用藥時，必須通過機體的吸收才能使藥物發(fā)揮療效，故在給畜禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，并予以足夠劑量、足夠療程，才會取得好的治療效果。例如新霉素腸道吸收較差，可以引起高濃度的腸道藥物濃度，治療腸道疾病是非常好的藥物。

誤診、濫用藥物導致病菌耐藥性：絕大多數養(yǎng)殖者或技術人員是在沒有明確微生物學診斷的情況下使用抗菌藥物，養(yǎng)殖場規(guī)模越小，細菌培養(yǎng)和藥敏試驗做的越少，最常見的是大多數養(yǎng)殖場輪翻使用多種抗菌藥物而不做細菌培養(yǎng)和藥敏試驗，致使療效不佳，治療時機延誤和藥品的浪費。一些病例用藥前不做藥敏試驗，而是在大量使用多種抗菌藥物療效不明顯時才想起做細菌培養(yǎng)和藥敏試驗，而此時細菌已對多種抗菌藥產生耐藥性。

不了解致病菌特性：臨床上存在一些營養(yǎng)需求較高的細菌或微生物，如鏈球菌和支原體，臨床上較難培養(yǎng)，這些疾病是不能使用藥敏試驗獲得結果，往往分離到的一些無關細菌導致藥敏試驗失敗。

沒有真正理解藥敏試驗：方法學不統(tǒng)一，沒有標準化，隨意改動藥敏試驗步驟，隨意改動藥物濃度，隨意改動培養(yǎng)時間等。

三、解決措施

那么如何才能獲得與藥敏試驗一致的治療效果呢？正確的藥敏試驗可獲得敏感性較高、價廉、易得、安全的藥物進行治療，同時減少耐藥菌株產生。具體措施分享如下：

（1）正確理解抑菌圈數值：藥敏試驗結果僅為臨床選擇高敏藥物的參考。因動物機體及環(huán)境等因素影響，藥物的藥敏試驗與臨床治療效果的符合率一般為70%～80%，所以也不能過分地依賴藥敏試驗，如發(fā)現療效不顯著應及時換藥。

（2）定期監(jiān)控本場細菌耐藥性：藥敏試驗確定的首選藥物不是一成不變。隨著藥物使用頻率的增加及新特藥的不斷出現，細菌對原先的高敏感藥物可能不再敏感。因此，定期進行藥敏試驗了解本場細菌對抗菌藥的敏感性情況是很有必要的。

（3）藥敏試驗藥物選擇原則：避開已經使用過的藥物或其同類藥物，發(fā)病期間已用過的藥物或同類藥物一般不用。

（4）臨床選藥要慎重：①窄譜抗生素能解決的問題不選廣譜抗生素，一種抗生素可達到治療作用時，不要輕易用兩種藥物聯合應用。②必須應用兩種抗生素時，應選擇聯合應用具有協同作用的藥物。③在選擇高敏藥物時要考慮藥物的吸收途徑及其藥動學，有的放矢。

（5）開展聯合藥敏實驗：①病因不明而又危及生命的嚴重感染。②單一抗菌藥不能有效控制的混合感染及嚴重感染。③長期治療、細菌易產生耐藥性的慢性感染。一般抗菌藥不易透入病灶的感染。④毒性較大，聯合用藥減少劑量后可降低毒副反應的抗菌藥。臨床上出現以下情況需要聯合用藥，這種情況下必須進行聯合藥敏試驗。

總之，獸醫(yī)臨床中紙片法藥敏試驗結果受到多種因素的影響，在沒有標準和嚴格操作規(guī)程的情況下，抑菌圈的大小體現出一個細菌對藥物體外的敏感度的高低，也就是說這種藥物抑菌圈的有無或大小只能判斷出該藥對細菌有沒有效果，敏感性的高低只能通過科學、嚴格的實驗來確定。