海馬齒狀回區(qū)D1受體激活對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用

萬朋，高俊濤，王丹，王師，金清華

(1 吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室，吉林吉林 132013；2 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室)

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海馬齒狀回區(qū)D1受體激活對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用

萬朋1，高俊濤1，王丹2，王師2，金清華2

(1 吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室，吉林吉林 132013；2 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室)

摘要：目的觀察海馬齒狀回(DG)區(qū)D1受體激活對(duì)血管性癡呆(VD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用。方法32只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD模型組1、VD模型組2、VD模型SKF38393激動(dòng)劑組，各8只，后三組制備VD模型，后兩組采用腦部微量注射法于大鼠海馬DG區(qū)分別注射生理鹽水、D1受體激動(dòng)劑SKF38393。應(yīng)用Morris水迷宮進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)評(píng)估，HE染色法觀察大鼠海馬DG區(qū)病理組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 VD模型組1、假手術(shù)組逃避潛伏期分別為(75.73±4.41)、(50.13±4.48)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組1、假手術(shù)組穿越原站臺(tái)區(qū)的次數(shù)分別為(2.67±0.67)、(7.67±0.88)次，兩組比較，P<0.05。HE染色結(jié)果顯示，VD模型組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，可見壞死的神經(jīng)元。VD模型組2和VD模型SKF38393激動(dòng)劑組逃避潛伏期分別為(78.23±7.38)、(57.46±4.81)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組2和VD模型SKF38393激動(dòng)劑組穿越原平臺(tái)區(qū)的次數(shù)分別為(2.67±0.50)、(5.33±0.51)次，兩組比較，P<0.05。結(jié)論 海馬DG區(qū)的D1受體激活可改善VD大鼠受損的學(xué)習(xí)記憶能力。

關(guān)鍵詞：血管性癡呆；海馬DG區(qū)；D1受體；Morris水迷宮；學(xué)習(xí)記憶能力

血管性癡呆(VD)是一系列腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害而引起的，以記憶、認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的智能損害綜合征[1]。VD已成為全球第二大類型的癡呆[2]，預(yù)防和治療VD已成為社會(huì)廣泛關(guān)注的問題[3]。認(rèn)知功能障礙是VD最顯著的臨床表現(xiàn)，海馬是認(rèn)知功能的關(guān)鍵腦區(qū)[4]，VD的認(rèn)知功能障礙程度與海馬萎縮相關(guān)[5]。海馬齒狀回(DG)區(qū)可能參與VD的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙[6～9]。本課題組前期研究[10]證明，VD模型大鼠海馬DG區(qū)的DA含量減少，但對(duì)DG內(nèi)D1受體在空間學(xué)習(xí)記憶中的作用尚未見報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)觀察了海馬DG區(qū)D1受體激活對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量250～300 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供[許可證號(hào)：SCXK(吉)2011-0007]。將所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD模型組1、VD模型組2和VD模型SKF38393激動(dòng)劑組，各8只。

1.2VD模型大鼠的制備VD模型組1、VD模型組2、VD模型SKF38393激動(dòng)劑組大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行麻醉，頸部正中線左側(cè)旁開0.5 cm處做一個(gè)長(zhǎng)約1 cm的切口，分離頸總動(dòng)脈后用醫(yī)用4號(hào)手術(shù)絲線雙重結(jié)扎。7 d后于頸部正中線右側(cè)旁開0.5 cm處做一個(gè)長(zhǎng)約1 cm的切口，分離頸總動(dòng)脈用醫(yī)用4號(hào)手術(shù)絲線雙重結(jié)扎。假手術(shù)組除了不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其余步驟均與上述相同。各組動(dòng)物術(shù)后單獨(dú)飼養(yǎng)1周后合籠，并在模型制備完成30 d后進(jìn)行模型的病理學(xué)和生理學(xué)的驗(yàn)證，確定模型建立成功后開始進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[11]。

1.3SKF38393注射方法大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)行腹腔麻醉，手術(shù)根據(jù)Paxinos和Watson圖譜進(jìn)行腦部定位，以前囟為參考點(diǎn)，將透析用外套管垂直插入固定于一側(cè)海馬DG區(qū)(定位坐標(biāo)為AP 3.2 mm，L/R 1.6 mm，H 2.5 mm)。然后用牙科水泥將套管固定在大鼠顱骨上。適應(yīng)環(huán)境24 h后將微量注射探針植入外套管內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。VD模型組2、VD模型SKF38393激動(dòng)劑組分別在每天上午8時(shí)在大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)注射1 μL的生理鹽水和D1受體激動(dòng)劑SKF38393，注射SKF38393的濃度為1 μg/μL，注射時(shí)間為1 min，30 min后進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練。

1.4大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)利用Morris水迷宮觀察所有大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。Morris水迷宮檢測(cè)時(shí)，水池中水深約45 cm，水溫保持在(22±2)℃，將直徑10 cm的圓形平臺(tái)放于任一象限的中心位置，并淹沒于水面下約2 cm。定位航行試驗(yàn)時(shí)，若大鼠在120 s內(nèi)找到站臺(tái)，記錄所需的時(shí)間作為逃避潛伏期；若大鼠在120 s內(nèi)未找到站臺(tái)，則將其引至站臺(tái)并停留15 s，潛伏期記為120 s。大鼠每天訓(xùn)練1次，連續(xù)訓(xùn)練4 d。水迷宮檢測(cè)第5天，進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，即撤去水池中的圓形平臺(tái)，從同一個(gè)入水點(diǎn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入水中，測(cè)量大鼠在120 s內(nèi)穿越原站臺(tái)象限的次數(shù)。

1.5大鼠海馬DG區(qū)病理組織形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取假手術(shù)組、VD模型組1大鼠的腦組織，在4%多聚甲醛中浸泡固定。將海馬組織用石蠟包埋，用切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm，隔三取一，用常規(guī)HE染色法觀察海馬DG區(qū)病理組織形態(tài)，分別在200倍和400倍光學(xué)顯微鏡下觀察海馬DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

VD模型組1、假手術(shù)組逃避潛伏期分別為(75.73±4.41)、(50.13±4.48)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組1、假手術(shù)組穿越原站臺(tái)區(qū)的次數(shù)分別為(2.67±0.67)、(7.67±0.88)次，兩組比較，P<0.05。HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量多，體積大，染色均一，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜、核膜清晰，核圓、核仁明顯；VD模型組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞外空隙增大，多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞核呈固縮狀,胞質(zhì)深染，細(xì)胞膜、核膜界限不清晰，可見壞死的神經(jīng)元。

VD模型組2和VD模型SKF38393激動(dòng)劑組逃避潛伏期分別為(78.23±7.38)、(57.46±4.81)s，兩組比較，P<0.05。VD模型組2和VD模型SKF38393激動(dòng)劑組穿越原平臺(tái)區(qū)的次數(shù)分別為(2.67±0.50)、(5.33±0.51)次，兩組比較，P<0.05。

3討論

VD是由缺血、血管損傷出血、急慢性缺氧等一系列因素導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)與功能廣泛受損而引起的，以認(rèn)知功能障礙為特征的獲得性智能損害綜合征，它具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高等特點(diǎn)[12]。目前，基礎(chǔ)研究主要是通過觀察VD模型動(dòng)物的相關(guān)行為，腦血流的變化，腦區(qū)細(xì)胞的形態(tài)、功能、生化等指標(biāo)研究VD的發(fā)病機(jī)制[13]。利用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD模型大鼠已廣泛用于癡呆的相關(guān)研究[11]，改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法在保持傳統(tǒng)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，大大提高了模型動(dòng)物的存活率和模型制備成功率。本實(shí)驗(yàn)利用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型，并利用Morris水迷宮觀察其空間學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果顯示，在Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，VD大鼠的平均逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組；在Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中，VD大鼠穿越原平臺(tái)區(qū)的次數(shù)明顯少于假手術(shù)組，提示本實(shí)驗(yàn)制備的VD模型大鼠出現(xiàn)了空間學(xué)習(xí)記憶的損害。

海馬是學(xué)習(xí)記憶功能的重要腦區(qū)，它直接參與信息的儲(chǔ)存和再現(xiàn)過程，尤其在辨別空間信息、新異刺激和短時(shí)記憶向長(zhǎng)時(shí)記憶的過度中起重要作用[14]。利用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型時(shí)，隨著時(shí)間的推移，早期的急性腦缺血因基底動(dòng)脈環(huán)的血流調(diào)節(jié)和側(cè)支循環(huán)的代償而有所改善，腦血流量趨于穩(wěn)定，但海馬區(qū)得不到正常水平供血，造成慢性缺血，導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，最終引起VD的認(rèn)知障礙[15]。本實(shí)驗(yàn)VD大鼠海馬DG區(qū)HE染色可見神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，提示DG區(qū)神經(jīng)元損傷可能是VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損害的直接原因之一。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在VD大鼠海馬DG區(qū)微量注射D1受體激動(dòng)劑SKF38393可明顯提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。有研究[16]證明，激活海馬內(nèi)的D1受體能增加AMPA受體的表達(dá)，同時(shí)能修復(fù)損毀的海馬神經(jīng)元。通過前期的研究，我們認(rèn)為激活D1受體可加強(qiáng)興奮性氨基酸的興奮傳遞過程，并減弱GABA的抑制作用，進(jìn)而易化空間學(xué)習(xí)記憶過程，但其具體的下游機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Brundel M, de Bresser J, van Dillen JJ, et al. Cerebral microinfarcts: a systematic review of neuropathological studies[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2012,32(3):425-436.

[2] Catindig JA, Venketasubramanian N, Ikram MK, et al. Epidemiology of dementia in Asia: insights on prevalence, trends and novel risk factors[J]. J Neurol Sci, 2012,15(1-2):11-16.

[3] Rincon F, Wright CB. Vascular cognitive impairment[J]. Curr Opin Neurol, 2013,26(1):29-36.

[4] Buzsáki G, Moser EI. Memory, navigation and thetarhythm in the hippocampal-entorhinal system[J]. Nat Neurosci, 2013,16(2):130-138.

[5] Logue MW, Posner H, Green RC, et al. Magnetic resonance imaging-measured atrophy and its relationship to cognitive functioning in vascular dementiaand Alzheimer′s disease patients[J]. Alzheimers Dement, 2011,7(5):493-500.

[6] Jeltsch H, Bertrand F, Lazarus C, et al. Cognitive performances and locomotor activity following dentate granule cell damage in rats: role of lesion extent and type of memory tested[J]. Neurobiol Learn Mem, 2001,76(1):81-105.

[7] Epp JR, Haack AK, Galea LA. Activation and survival of immature neurons in the dentate gyrus with spatial memory is dependent on time of exposure to spatial learning and age of cells at examination[J].Neurobiol Learn Mem, 2011,95(3):316-325.

[8] Luo P, Lu Y, Li C, et al. Long-lasting spatial learning and memory impairments caused by chronic cerebral hypoperfusion associate with a dynamic change of HCN1/HCN2 expression in hippocampal CA1 region[J]. Neurobiol Learn Mem, 2015,123:72-83.

[9] Morris AM, Churchwell JC, Kesner RP, et al. Selective lesions of the dentate gyrus produce disruptions in place learning for adjacent spatial locations[J]. Neurobiol Learn Mem, 2012,97(3):326-331.

[10] Gangarossa G, Longueville S, De Bundel D, et al. Characterization of dopamine D1 and D2 receptor-expressing neurons in the mouse hippocampus[J]. Hippocampus, 2012,22(12):2199-2207.

[11] Wan P, Wang S, Zhang Y, et al. Involvement of dopamine D1 receptors of the hippocampal dentate gyrus in spatial learning and memory deficits in a rat model of vascular dementia[J]. Pharmazie, 2014,69(9):709-710.

[12] Yang S, Zhou G, Liu H, et al. Protective effects of p38 MAPK inhibitor SB202190 against hippocampal apoptosis and spatial learning and memory deficits in a rat model of vascular dementia[J]. Biomed Res Int, 2013,2013:215798.

[13] SorrentinoG, Migliaccio R, Bonavita V. Treatment of vascular dementia: the route of prevention[J]. Eur Neurol, 2008,60(5):217-223.

[14] Aggleton JP, Vann SD, Oswald CJ, et al. Identifying cortical inputs to the rat hippocampus that subserve allocentric spatial processes: a simple problemwith a complex answer[J]. Hippocampus, 2000,10(4):466-474.

[15] Tsuchiya M, Sako K, Yura S, et al. Local cerebral glucose utilisation following acute and chronic bilateral carotid artery ligation in Wistar rats:relation to changes in local cerebral blood flow[J]. Exp Brain Res, 1993,95(1):1-7.

[16] Gao C, Sun X, Wolf ME. Activation of D1 dopamine receptors increases surface expression of AMPA receptors and facilitates their synaptic incorporation in cultured hippocampal neurons[J]. J Neurochem, 2006,98(5):1664-1677.

·基礎(chǔ)研究·

收稿日期：(2015-08-10)

通信作者：金清華

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31160211)。

中圖分類號(hào)：R743；Q427

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)47-0023-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.008