人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白的表達(dá)變化及其意義

王明國(guó)，王向鵬，楊智勇，段奎甲，宋曉斌，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

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人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白的表達(dá)變化及其意義

王明國(guó)，王向鵬，楊智勇，段奎甲，宋曉斌，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

摘要：目的觀察人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)59例份人腦膠質(zhì)瘤組織，5例份正常腦組織中的ABCG2蛋白，并分析其與腦膠質(zhì)瘤患者年齡、性別、病理分級(jí)、腫瘤部位臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比為19.27%±16.80%，正常人腦組織為0，兩者比較，P<0.05。WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為6.40%±2.77%、11.13%±8.69%、17.25%±10.90%、31.94%±20.32%，WHO Ⅲ、Ⅳ級(jí)與WHO Ⅰ、Ⅱ 級(jí)比較，P<0.05。年齡≤45歲、>45歲者ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為15.02%±12.07%、25.06%±20.52%，兩者比較，P<0.05。結(jié)論 ABCG2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、年齡有關(guān)，可能有助于判斷膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為、預(yù)后、化療效果。

關(guān)鍵詞：腦腫瘤；膠質(zhì)瘤；ABCG2蛋白

腦膠質(zhì)瘤多呈高度浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，預(yù)后較差，極易復(fù)發(fā)。手術(shù)仍是腦膠質(zhì)瘤最主要的治療方式，術(shù)后常需輔助化療，但隨著腫瘤多藥耐藥性(MDR)的出現(xiàn)，化療藥物作用的敏感性降低，而化療抵抗是引起患者預(yù)后不良的重要因素之一[1,2]。因此，探索膠質(zhì)瘤MDR的相關(guān)作用機(jī)制及其有效逆轉(zhuǎn)策略成為腦腫瘤研究的熱點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在多種耐藥腫瘤細(xì)胞株中過(guò)度表達(dá)，提示ABCG2作為一種半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在腫瘤化療的多藥耐藥中具有重要作用。本研究觀察了人膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1組織標(biāo)本人膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本來(lái)自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2014年6月～2015年6月手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷確定的59例份膠質(zhì)瘤組織，標(biāo)本收集前均經(jīng)患者及家屬同意，術(shù)前均未行任何其他輔助治療。59例患者中男28例、女31例，年齡14～77歲、中位年齡46歲。WHO病理分級(jí)Ⅰ級(jí)11例、Ⅱ級(jí)9例、Ⅲ級(jí)19例、Ⅳ級(jí)20例。另收集取自本科室各種手術(shù)入路及手術(shù)減壓術(shù)中切除的正常腦組織標(biāo)本5例份作為對(duì)照。

1.2主要試劑小鼠抗人ABCG2單克隆抗體(美國(guó)abcam公司)；Super Vision超敏兩步法免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3ABCG2蛋白檢測(cè)方法采用免疫組化染色法。所有組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后作5 μm厚組織切片。組織切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化，并進(jìn)行抗原熱修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，5% BSA封閉后，滴加稀釋好的ABCG2于4 ℃孵育過(guò)夜，次日用PBS漂洗數(shù)次后，滴加聚合HRP標(biāo)記IgG。DAB試劑盒顯色5～10 min(光學(xué)顯微鏡下控制顯色程度)，脫水、透明、封片后觀察。PBS代替一抗作空白對(duì)照。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：ABCG2主要表達(dá)于細(xì)胞膜，部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染成棕褐色。于低倍光學(xué)顯微鏡下(×100)尋找細(xì)胞陽(yáng)性區(qū)域后，在高倍鏡(×400)下分別計(jì)數(shù)隨機(jī)5個(gè)視野中的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，以平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與平均細(xì)胞總數(shù)的比值百分比計(jì)算ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

2結(jié)果

人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比為19.27%±16.80%，正常人腦組織為0，兩者比較，P<0.05。ABCG2陽(yáng)性細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤中呈非均勻分布，部分區(qū)域可見陽(yáng)性細(xì)胞密度較高，聚集分布，陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一致，有時(shí)可見陽(yáng)性細(xì)胞成條索狀排列、類似毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)。ABCG2蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。WHO Ⅲ、Ⅳ級(jí)較WHO Ⅰ、Ⅱ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比高(P<0.05)。年齡>45歲者較年齡≤45歲者ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比高(P<0.05)。

表1　 ABCG2蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理

3討論

惡性膠質(zhì)瘤是我國(guó)最常見的腦腫瘤之一，其預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。目前手術(shù)仍是其最主要的治療方式，結(jié)合分子靶向治療及同步放化療的綜合治療策略在膠質(zhì)瘤的診療中顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)[4,5]。然而腫瘤的化療耐藥限制了惡性腫瘤患者的首次治療效果，一線治療方案失敗后的補(bǔ)救治療效果亦很差[6,7]。與其他各部位腫瘤化療一樣，腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌化療藥物的多藥耐藥是腦惡性腫瘤化療效果差的最重要原因。

Zhou等[8]報(bào)道，ABCG2基因可以作為一種通用的干細(xì)胞鑒定標(biāo)志物。且已有大量研究表明，在腫瘤組織中也存在著腫瘤干細(xì)胞并攜有ABCG2半轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，相關(guān)ABCG2半轉(zhuǎn)運(yùn)體在腫瘤干細(xì)胞中的生物學(xué)功效研究已成為近年癌癥治療研究中的熱點(diǎn)問題[9]。研究主要集中于ABCG2腫瘤干細(xì)胞的分選功能及其多藥耐藥功能[10,11]。將該基因轉(zhuǎn)染非耐藥的乳腺癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得了與耐藥細(xì)胞株MCF-7/AdrVp相似的耐藥特征，對(duì)甲氨蝶呤、米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素拓?fù)涮婵导捌浒牒铣晌锬退嶽3,12]。腫瘤干細(xì)胞或腫瘤中的側(cè)群細(xì)胞因表達(dá)ABCG2而產(chǎn)生耐藥的生物學(xué)特性，導(dǎo)致術(shù)后化療效果極差，是惡性腫瘤難以根除的原因之一[13]．

本研究結(jié)果顯示，正常人腦組織中未見ABCG2蛋白表達(dá)，而在各分級(jí)膠質(zhì)瘤組織中均有不同程度的表達(dá)，且病理分級(jí)WHO Ⅲ、Ⅳ級(jí)較WHO Ⅰ、Ⅱ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分比高。而只有處于干細(xì)胞階段的細(xì)胞才表達(dá)ABCG2，提示病理分級(jí)高的膠質(zhì)瘤組織存在更多的腦腫瘤干細(xì)胞，其臨床侵襲性更高，患者出現(xiàn)化療耐藥的可能性較大，與儲(chǔ)亮等[14]的研究結(jié)果一致。在本研究中，ABCG2免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈條索狀排列，部分區(qū)域可見陽(yáng)性細(xì)胞密度較高，聚集分布。提示腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生可能是以少數(shù)的腦腫瘤干細(xì)胞為生發(fā)根源，逐漸增殖分化并向臨近微環(huán)境遷移整合，歷經(jīng)此生物學(xué)過(guò)程，大量腦腫瘤干細(xì)胞分化成腫瘤細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞仍保持其干細(xì)胞特性。術(shù)后殘存的腫瘤干細(xì)胞可通過(guò)自我更新及多分化潛能，在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、耐藥過(guò)程中起關(guān)鍵作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤中ABCG2的表達(dá)與患者的性別、腫瘤生長(zhǎng)部位無(wú)關(guān)，而與患者的年齡密切相關(guān)，提示ABCG2的高表達(dá)可能源于細(xì)胞基因突變?cè)谀X腫瘤干細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期積累。以上研究結(jié)果提示，腦腫瘤干細(xì)胞使腫瘤具有對(duì)周圍腦組織的侵潤(rùn)能力和對(duì)放化療的抵抗性，是腦膠質(zhì)瘤高致死率和高復(fù)發(fā)率的根源。

相關(guān)研究[15]結(jié)果表明，黑色素瘤細(xì)胞中ABCG2的異常表達(dá)是細(xì)胞對(duì)Vemurafenib出現(xiàn)耐藥的重要分子機(jī)制之一，在人黑色素瘤A375細(xì)胞中敲低ABCG2可顯著改善Vemurafenib的藥物敏感性，證實(shí)ABCG2異常表達(dá)是機(jī)體對(duì)靶向藥物產(chǎn)生耐藥反應(yīng)的重要分子機(jī)制之一。因此，有可能通過(guò)干預(yù)ABCG2在腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)調(diào)控腫瘤干細(xì)胞增殖分化從而達(dá)到治愈癌癥的目的。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑能夠增加化療藥物在腦內(nèi)的積累。gefitinib的口服給藥能夠增加topotecan在神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤中的藥物濃度。這些研究都說(shuō)明了通過(guò)抑制ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能夠增高ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物譜中的藥物穿過(guò)血腦屏障的概率,增加這些藥物在神經(jīng)系統(tǒng)的積累,可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]。

綜上所述，人膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白表達(dá)增高，其表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、年齡有關(guān)。深入探究ABCG2的表達(dá)與腫瘤MDR及與腫瘤干細(xì)胞分化調(diào)控的相關(guān)作用機(jī)制[17]，將會(huì)對(duì)尋找新的癌癥治療策略提供新思路。ABCG2蛋白可能有助于判斷膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為、預(yù)后、化療效果，并可作為生物靶向治療的有效靶點(diǎn)。

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收稿日期：(2015-11-02)

通信作者：鄧興力

基金項(xiàng)目：云南省自然科學(xué)基金(2007C244M)；云南省衛(wèi)生廳科研 (2012ws0024)。

中圖分類號(hào)：R739.41

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2015)47-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.014