胰腺癌組織COX-2、VEGF、MMP-9的表達(dá)及塞來(lái)布昔對(duì)人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9表達(dá)的影響

蘇春永 霍華治 楊曉光

胰腺癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，該病惡性度極高，早期侵襲和轉(zhuǎn)移率高，病情進(jìn)展快，預(yù)后嚴(yán)重不良［1］。因此，從腫瘤過(guò)度增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制角度尋找有效的阻斷靶點(diǎn)對(duì)于胰腺癌的臨床治療具有重要指導(dǎo)意義。環(huán)氧合酶-2(COX-2)是花生四烯酸代謝過(guò)程中的限速酶之一，在細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞粘附、疼痛發(fā)生發(fā)展等病生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明，胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織高表達(dá)COX-2，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)，且與患者預(yù)后及存活時(shí)間高度相關(guān)［2］。最新研究發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)布昔通過(guò)抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮明顯的抗腫瘤作用［3，4］。然而，塞來(lái)布昔是否通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用的報(bào)道筆者所見(jiàn)目前尚少。本研究觀察胰腺癌組織 COX-2、VEGF、MMP-9的表達(dá)狀況，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的變化探討塞來(lái)布昔的抗腫瘤機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年9月至2011年3月我院手術(shù)切除的原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌組織標(biāo)本50例，均經(jīng)病理確診，臨床病理資料及隨訪資料完整。其中男30例，女20例;年齡29～67歲，平均年齡(50±7)歲;病程1～9年，平均(3.2±0.5)年。

1.2 主要試劑 胰腺癌BXPC-3細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。兔抗人COX-2、VEGF、MMP-9多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。Trizol、Real Time-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。免疫組化SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP法:采用免疫組化法檢測(cè)胰腺組織COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平，參照說(shuō)明書(shū)操作。將手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織置于4%多聚甲醛中固定，依次進(jìn)行脫蠟、水化、高壓鍋熱修復(fù)后加入特異性一抗4℃過(guò)夜;加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h;加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的三抗室溫孵育45 min，DAB顯色，蘇木素染色，封片，光鏡觀察。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):COX-2、VEGF、MMP-9陽(yáng)性染色的判定以細(xì)胞膜(質(zhì))中檢出棕黃色或深棕色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取5個(gè)有代表性的視野進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，若陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的比例＞5%為陽(yáng)性，≤5%則為陰性。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng):在37℃、5%CO2孵箱中用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BXPC-3細(xì)胞。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和塞來(lái)布昔低、中、高劑量組(終濃度分別為 25、50、100 μmol/L)。

1.3.3 Real Time-PCR(qPCR):采用 qPCR 方法檢測(cè)胰腺癌BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平，參照說(shuō)明書(shū)操作。Gene Bank網(wǎng)站獲取VEGF、MMP-9基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程有限公司合成。Trizol提取組織總RNA，將2.0 μg總RNA 用于后續(xù)的Real Time-PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增完畢后，以GAPDH為內(nèi)參照基因，目的基因VEGF、MMP-9表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)用于統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3.4 Western blot:收集并提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量蛋白后進(jìn)行 SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，特異性一抗4℃孵育過(guò)夜，IgG二抗孵育2 h，ECL顯色。采用UVP分析軟件對(duì)目的條帶及內(nèi)參照條帶做灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Sperman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織 COX-2、VEGF、MMP-9的表達(dá) 胰腺癌組織 COX-2、VEGF、MMP-9表達(dá)均為陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率分別為 72.00%(36/50)、78.00%(39/50)、74.00%(37/50)，與癌旁組織 6.00%(3/50)、8.00%(4/50)、6.00%(3/50)的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胰腺癌組織、癌旁組織COX-2、VEGF、MMP-9表達(dá)的比較n=50，例(%)

2.2 COX-2、VEGF、MMP-9 蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示，COX-2、VEGF、MMP-9在低增殖活性組和高增殖活性組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 38.46%(5/13)、23.08%(3/13)、30.77%(4/13)和 83.78%(31/37)、89.19%(33/37)、86.49%(32/37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05);COX-2、VEGF、MMP-9在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組和Ⅲ～Ⅳ組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 45.00%(9/20)、40.00%(8/20)、35.00%(7/20)和 90.00%(27/30)、93.33%(28/30)、96.67%(29/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);COX-2、VEGF、MMP-9 在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 90.32%(28/31)、93.55%(29/31)、96.77%(30/31)和 42.11%(8/19)、36.84%(7/19)、31.58%(6/19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。COX-2、VEGF、MMP-9 蛋白表達(dá)均與胰腺癌患者的年齡、性別、腫瘤位置、病理分級(jí)無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 相關(guān)性分析 Sperman相關(guān)分析顯示，胰腺癌組織COX-2與 VEGF、MMP-9表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.597、0.623，P＜0.05)。

表3 COX-2、VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系n=50，例(%)

2.4 COX-2、VEGF、MMP-9 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)對(duì)50例患者術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)后＞1年和≤1年的患者COX-2陽(yáng)性表達(dá)率分別為40.00%(6/15)、85.71%(30/35)，平均生存時(shí)間為(21.12 ±2.11)個(gè)月、(9.24±1.35)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)后＞1年和≤1年的患者VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為 40.00%(6/15)、94.29%(33/35)，平均生存時(shí)間分別為(21.47 ±2.36)個(gè)月、(9.68 ±1.34)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)后 ＞1年和≤1年的患者 MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率為 20.00%(3/15)、97.14%(34/35)，平均生存時(shí)間為(22.12 ±2.42)個(gè)月、(9.13 ±1.25)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明COX-2、VEGF、MMP-9表達(dá)陰性的患者預(yù)后明顯好于COX-2、VEGF、MMP-9表達(dá)陽(yáng)性的患者。

2.5 塞來(lái)布昔對(duì) BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，塞來(lái)布昔處理24 h后，隨著劑量增加VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平均有不同程度下降，呈劑量依賴性(P＜0.05)。采用50 μmol/L塞來(lái)布昔處理細(xì)胞觀察不同時(shí)間點(diǎn)VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果表明隨著時(shí)間延長(zhǎng)VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)水平均有不同程度下降，呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。見(jiàn)表4、5。

表4 塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 ±s

表4 塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 ±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與低劑量組比較，#P ＜0.05;與中劑量組比較，△P ＜0.05

組別VEGF mRNA MMP-9 mRNA對(duì)照組1.94 ±0.31 1.76 ±0.25低劑量組 1.43 ±0.24* 1.30 ±0.19*中劑量組 1.05 ±0.16*# 0.89 ±0.14*#高劑量組 0.64±0.11*#△ 0.43±0.07*#△

表5 不同時(shí)段塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 ±s

表5 不同時(shí)段塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 ±s

注:與24 h比較，*P ＜0.05;與48 h 比較，#P ＜0.05

組別VEGF mRNA 24 h 48 h 72 h MMP-9 mRNA 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 1.94 ±0.31 1.98 ±0.33 1.95 ±0.30 1.76 ±0.25 1.73 ±0.26 1.75 ±0.28中劑量組 1.05 ±0.16 0.77 ±0.12* 0.58 ±0.08*# 0.89 ±0.14 0.70 ±0.11* 0.51 ±0.07*#

2.6 塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 塞來(lái)布昔處理24 h后，隨著劑量增加VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降，呈劑量依賴性(P＜0.05)。采用50 μmol/L塞來(lái)布昔處理細(xì)胞觀察不同時(shí)間點(diǎn)VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果表明隨著時(shí)間延長(zhǎng)VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降，呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。見(jiàn)表6、7。

表6 塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 ±s

表6 塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 ±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與低劑量組比較，#P ＜0.05;與中劑量組比較，△P ＜0.05

組別 VEGF蛋白 MMP-9蛋白對(duì)照組1.72 ±0.27 1.63 ±0.25低劑量組 1.29 ±0.21* 1.17 ±0.19*中劑量組 0.87 ±0.14*# 0.69 ±0.11*#高劑量組 0.50±0.08*#△ 0.38±0.05*#△

表7不同時(shí)段塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 ±s

表7不同時(shí)段塞來(lái)布昔對(duì)BXPC-3細(xì)胞VEGF、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 ±s

注:與24 h比較，*P ＜0.05;與48 h 比較，#P ＜0.05

組別 VEGF蛋白24 h 48 h 72 h MMP-9蛋白24 h 48 h 72 h對(duì)照組 1.72 ±0.27 1.74 ±0.30 1.75 ±0.35 1.63 ±0.25 1.62 ±0.26 1.65 ±0.25中劑量組 0.87 ±0.14 0.61 ±0.10* 0.42 ±0.07*# 0.69 ±0.11 0.52 ±0.08* 0.39 ±0.06*#

3 討論

COX-2是一種誘導(dǎo)型酶，在正常組織極少表達(dá)，而在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、喉癌等惡性腫瘤組織高表達(dá)，預(yù)示患者預(yù)后不良、生存期短。研究顯示，生長(zhǎng)因子、炎性因子、缺氧及致癌物質(zhì)等因素刺激細(xì)胞大量表達(dá)COX-2，具有誘導(dǎo)細(xì)胞惡變、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞凋亡等作用［2］。其可能的作用機(jī)制:(1)腫瘤細(xì)胞PGE2的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的異常增殖，同時(shí)抑制機(jī)體免疫力，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸;(2)COX-2通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl的表達(dá)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡;(3)COX-2能夠促進(jìn)VEGF的表達(dá)及腫瘤新生血管的形成，而VEGF高表達(dá)又可正反饋調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)，二者對(duì)腫瘤血管生成發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用［5］;(4)COX-2能夠誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)MMPs，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散［6］。

本研究結(jié)果顯示，COX-2、VEGF、MMP-9在胰腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率(分別為72.00%、78.00%、74.00%)顯著高于癌旁組織(分別為6.00%、8.00%、6.00%)，與Guo等［7］在胃癌﹑乳腺癌等組織的研究結(jié)果一致;且三者表達(dá)與胰腺癌臨床分期、增殖活性、一年期生存率及腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、性別、發(fā)病部位、病理組織分級(jí)無(wú)關(guān)(P＞0.05)，表明COX-2、VEGF、MMP-9過(guò)表達(dá)可能和胰腺癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)。COX-2、VEGF、MMP-9表達(dá)互相調(diào)節(jié)、協(xié)同作用，共同導(dǎo)致腫瘤的過(guò)度增殖、侵襲和擴(kuò)散［8，9］。

塞來(lái)布昔是選擇性COX-2抑制劑，屬于非甾體抗炎藥。近年來(lái)研究顯示，塞來(lái)布昔通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤新生血管生成等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等惡性腫瘤的防治中［3，4］。但COX-2抑制劑在胰腺癌組織的作用機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選取BXPC-3細(xì)胞為研究對(duì)象，采用RT-QPCR和Western blot檢測(cè)塞來(lái)布昔對(duì)培養(yǎng)的胰腺癌BXPC-3細(xì)胞中VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，塞來(lái)布昔能夠顯著抑制BXPC-3細(xì)胞中VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平，呈劑量和時(shí)間依賴性，提示塞來(lái)布昔對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用，這可能是塞來(lái)布昔發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究結(jié)果表明胰腺癌組織高表達(dá)COX-2、VEGF、MMP-9，且三者表達(dá)具有正相關(guān)性，提示COX-2、VEGF、MMP-9發(fā)揮協(xié)同作用，共同參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，COX-2、VEGF、MMP-9與胰腺癌臨床分期、增殖活性、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀況及預(yù)后密切相關(guān)。COX-2可能通過(guò)促進(jìn)VEGF、MMP-9等基因表達(dá)增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布能夠顯著抑制胰腺癌BXPC-3細(xì)胞中VEGF、MMP-9的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

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