基因檢測葉酸利用能力的個體差異性臨床觀察

魏海青 郭燕 胡殿珍 羅環(huán)

葉酸(Folic acid)維生素B復合體之一，是米切爾(H.K.Mitchell，1941)從菠菜葉中提取純化的，故而命名為葉酸。是合成核酸所必需的元素，是細胞生長和組織修復所必需的物質(zhì)，更是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素。有“優(yōu)生優(yōu)育的營養(yǎng)素”美譽，對孕婦尤其重要［1］。1997年衛(wèi)生部開始推薦孕女性性統(tǒng)一補充葉酸，劑量為400 μg/d。該措施在出生缺陷預防中起了重要作用，但由于孕婦對葉酸的代謝能力不足，出生缺陷的發(fā)生率仍存在很大的地域差異。對于葉酸代謝能力正常的孕婦來說，每天補充400 μg葉酸是足夠的，但是對葉酸代謝能力存在障礙的孕婦來說，應該相應增加補充劑量，并加強孕期各項檢測。據(jù)我國婚前育齡女性血清抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國城市和農(nóng)村女性缺乏葉酸者分別有21%和38%。而孕婦由于攝入不足、胎兒需要量大、尿中排除量比平時多等原因更容易缺乏葉酸。據(jù)衛(wèi)生部及疾控中心相關(guān)報告，我國每年將有90萬新生兒缺陷性疾病誕生，患出生缺陷排在前5位的包括:先天性心臟病，神經(jīng)管畸形，唇腭裂，唐氏綜合征，多指(趾)，這些多與孕婦葉酸缺乏有一定關(guān)系。當前，為了降低新生兒出生缺陷，孕婦妊高癥和流產(chǎn)的發(fā)病率，臨床上根據(jù)衛(wèi)生部推薦孕期女性統(tǒng)一補充葉酸的劑量為400 μg/d，但由于每個人葉酸能力代謝不同，利用能力也出現(xiàn)差異，仍然出現(xiàn)一定數(shù)量的新生兒缺陷性疾病。因此通過基因位點檢測，個性化補充葉酸，特別是研究基因突變則是探討這些疾病發(fā)生機制的關(guān)鍵。利用現(xiàn)代基因分型技術(shù)檢測孕母葉酸代謝相關(guān)基因，根據(jù)基因分型結(jié)果對受檢者葉酸利用能力進行分級，進而針對性的調(diào)整葉酸補充劑量具有深遠的意義。［2］

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在2014年1月至12月對河北省豐寧滿族自治縣計劃生育技術(shù)服務站和北京市預防醫(yī)學研究中心進行了葉酸利用能力遺傳基因檢測的圍孕期女性400例，年齡21～40歲，以上病例均由指定幾家醫(yī)院及計劃生育研究所提供相關(guān)調(diào)查表并跟蹤記錄。按照有無不良孕史分為有不良孕史的為觀察組(n=68)，無不良孕史為對照組(n=332)。觀察組21～25歲22例，26～30歲26例，31～35歲10例，36～40歲2例。對照組21～25歲68例，26～30歲196例，31～35歲46例，36～40歲22例。同時也進行了對個體化葉酸補充相關(guān)知識的了解情況的調(diào)查，對這68例有不良孕產(chǎn)史的圍孕期女性的個體化葉酸補充知識了解情況進行統(tǒng)計，了解葉酸個體化補充相關(guān)知識的32例，不了解的36例;對這332例有不良孕產(chǎn)史的圍孕期女性的個體化葉酸補充知識了解情況進行統(tǒng)計，了解個體化葉酸補充相關(guān)知識的占172例，不了解的占160例。

1.2. 檢查方法:采用咽拭子法。讓受檢者用0.9%氯化鈉溶液漱口2次后，通過采樣器咽拭子在被檢者口腔黏膜刮取脫落細胞，提取DNA，采用Taqman-MGB技術(shù)，對亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因-C677T、A1298C和MTRR基因位點-A66G的單核苷酸多態(tài)性分型進行熒光定量PCR檢測，相關(guān)儀器、試劑均為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR結(jié)果 經(jīng)終點熒光讀取，區(qū)分檢測樣本攜帶的不同基因型(雜合、野生純合、突變純合)，經(jīng)實驗室數(shù)據(jù)綜合，以上每個檢測樣本的三個基因位點數(shù)據(jù)均被采集。

2.2 葉酸利用能力遺傳檢測相關(guān)結(jié)果統(tǒng)計情況

2.2.1 葉酸利用能力遺傳檢測基因型情況:葉酸利用能力遺傳檢測基因型情況包括雜合型、野生純合型［3］、突變純合型。關(guān)于MTHFR基因位點C677T上的基因型常見的有CC(正常)，CT(正常)、TT(風險)，其中TT風險基因型在我國人群中所占比例為28%;關(guān)于MTHFR基因位點A1298C上的基因型常見的有AA(正常)、AC(正常)、CC(風險)，其中，CC 風險基因型在我國人群中所占比例為4%;關(guān)于MTRR基因位點A66G上的基因型常見的有AA(正常)、AG(正常)、GG(風險)，其中GG風險基因型在我國人群中所占比例6%。見表1。

表1 葉酸利用能力檢測基因型情況

2.2.2 葉酸利用能力風險等級情況:根據(jù)各基因位點功能、純合、雜合及出現(xiàn)頻率，葉酸利用能力風險等級情況一般分為七級，其中零級為未發(fā)現(xiàn)風險，表明葉酸利用能力正常;一級和二級為低度風險，表明葉酸利用能力略差;三級、四級和五級為中度風險，表明葉酸利用能力較差;六級和七級為高度風險，表明葉酸利用能力很差。見表2。

表2 葉酸利用能力基因檢測風險等級情況

2.2.3 觀察組與對照組葉酸利用能力統(tǒng)計情況:根據(jù)葉酸利用能力基因檢測中基因分型結(jié)果，對受檢者葉酸利用能力進行分級，統(tǒng)計結(jié)果如下:觀察組68例患者中，葉酸利用能力正常的為1例，占1.47%;葉酸利用能力略差的為8例，占11.76%;葉酸利用能力較差的為49例占72.06%;葉酸利用能力很差的為10例，占14.71%。對照組332例患者中，葉酸利用能力正常的為50例，占15.06%;葉酸利用能力略差的為112例，占33.73%;葉酸利用能力較差的為146例占43.98%;葉酸利用能力很差的為24例，占7.23%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2組患者葉酸利用能力級別情況(正常、略差、較差、很差)比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 2組葉酸利用能力級別情況對比 例(%)

2.2.4 個體化補充葉酸參考量:對MTHFR基因、MTRR基因及其相關(guān)位點的檢測，可以直接發(fā)現(xiàn)被檢測者葉酸代謝方面的遺傳缺陷(即葉酸的利用能力)，從而根據(jù)風險高低(相關(guān)代謝酶的活性程度)建議更準確的補充劑量，例如:對于葉酸利用能力基因檢測結(jié)果正常的孕齡女性，在孕前3個月至孕早期補充400 μg/d，孕后期注意食物補充就可以了;對于檢測結(jié)果略差的注意孕前3個月、孕早期、孕中及后期堅持補充400 μg/d;對于檢測結(jié)果較差的孕齡女性，注意孕前3個月補充 400 μg/d，而孕早期注意增加到800 μg/d，孕中及后期 400 μg/d;對于檢測結(jié)果很差的孕齡女性，注意在孕前3個月及孕早期均補充800 μg/d，孕中及后期補充 400 μg/d。由中國疾病預防控制中心婦幼保健中心組織的孕齡女性(孕前3個月、孕早期、孕中/孕后期)葉酸利用能力檢測所提供的增補參考量情況。見表4。

表4 葉酸利用能力基因檢測提供的增補參考量情況 μg/d

3 討論

葉酸作為水溶性B族維生素中的一種，過去認為它主要是參與造血。但隨著對其研究的深入，它的缺乏與多種疾病有關(guān)，特別與孕婦和新生兒疾病有著密切的關(guān)系。導致機體缺乏葉酸有兩個方面的原因:(1)葉酸攝入量不足，(2)由于遺傳(基因)缺陷導致機體對葉酸的利用能力低下即葉酸代謝通路發(fā)生障礙。而葉酸缺乏是導致新生兒出生缺陷的主要原因，應引起對孕婦葉酸利用能力檢測的高度重視。［4］

國外通過基因位點檢測，評估葉酸利用能力的強弱，個體化指導孕齡女性補充葉酸的研究開展較早，并收到很好的孕婦和新生兒疾病預防效果。但由于人種、遺傳因素、環(huán)境因素、飲食因素等的差異，有必要根據(jù)我國孕齡女性的現(xiàn)狀，進一步開展這方面的研究［5］。有相關(guān)葉酸利用能力遺傳(基因)檢測涉及的基因和位點的研究顯示:MTHFR全稱5，10-methylenetetrahydrofolatereductase(5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶)基因的C677T位點上的基因型有以下三種，CC(正常);CT(正常);TT(風險)，三種基因型在中國人群中所占比例分別為22%;50%;28%。MTHFR基因的A1298C位點上的基因型也有三種，AA(正常);AC(正常);CC(風險)，三種基因型在中國人群中所占比例分別為66%;31%;4%。MTRR基因全稱5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase，編碼甲硫氨酸合成酶還原酶，該基因的A66G位點上的三種基因型為AA(正常);AG(風險);GG(風險)，三種基因型在中國人群中所占比例分別為58%;36%;6%。綜上所述，通過對MTHFR基因、MTRR基因及其相關(guān)位點的檢測，可以直接發(fā)現(xiàn)被檢測者葉酸代謝方面的遺傳缺陷(即葉酸的利用能力)［6］，再依據(jù)以上各基因位點的功能、純合、雜合及其出現(xiàn)頻率可以進行風險分級，從而根據(jù)風險高低(正常、略差、較差、很差)建議個體化補充劑量。

近年來，不育不孕與新生兒出生缺陷發(fā)生率呈逐年上升趨勢，引起了醫(yī)療及政府相關(guān)部門的高度重視［7］。中國疾病預防控制中心婦幼保健中心于2007年先后三次向全國婦幼保健院發(fā)出關(guān)于開展“婦幼保健遺傳檢測服務項目”的函，指出:“為了提升婦幼保健服務的技術(shù)含量，將最新的預防檢測技術(shù)及時應用于婦幼保健服務?！笔灼谕瞥隽艘浴霸衅谌~酸需求遺傳檢測”為代表的15項“婦幼保健遺傳檢測服務項目”。

目前，國內(nèi)部分省市雖然已經(jīng)有關(guān)于葉酸利用能力基因檢測個體化指導孕婦補充葉酸的相關(guān)報道，但還不夠系統(tǒng)和全面，特別是缺乏通過葉酸利用能力基因檢測孕齡女性分階段個體化補充葉酸全過程的跟蹤調(diào)查結(jié)果還尚無相關(guān)報道［8］。通過基因檢測技術(shù)手段，對人體MTHFR基因及MTRR基因做檢測，可以及早發(fā)現(xiàn)不同個體對葉酸的吸收利用水平［9］，從而篩查出容易引起葉酸缺乏的高危人群，實現(xiàn)個性化增補葉酸，同時加強產(chǎn)前檢查，以降低新生兒出生缺陷風險［10］。因此，需要不斷開展系列研究，特別是有關(guān)某些基因多態(tài)性的研究，有科學意義和實用價值。

以上葉酸利用能力基因檢測結(jié)果顯示:觀察組的有不良孕產(chǎn)史組患者葉酸利用能力較差或很差所占比例明顯高于對照組的既往無不良孕產(chǎn)史患者(P＜0.05)。而對照組患者葉酸利用能力也存在明顯的個體差異。

因此，過去采用補充相同劑量的葉酸預防孕婦及新生兒缺陷性疾病有一定的局限性，建議圍孕期女性通過葉酸利用能力的遺傳基因檢測有針對性的調(diào)整葉酸補充劑量。

1 Lamb NE，Yu K，Shaffer J，et al.Association between mater-nalage and meioticre combination fortrisomy.Am J Hum Genet，2005，76:91.

2 Popiela A，Keith G，Borzecki A，et al.The meaning of themehylation of genomic DNA in the regulation of gene expres-sionlevels.Eur J Gynaecol Oncol，2004，25:145.

3 賀憲民，張群，楊琦，等.亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態(tài)性研究.中國計劃生育學雜志，2010，19:35-37.

4 鄭山，白亞娜，胡曉斌，等.孕產(chǎn)婦葉酸知曉途徑及其家人對服用葉酸影響.中國公共衛(wèi)生，2011，27:45-47.

5 張親鳳，林燕玲，薛燕燕，等.熒光定量PCR用于孕婦葉酸利用能力檢測研究.中國熱帶醫(yī)學，2010，10:32-35.

6 何燕霞，鞏姣梅，沈勇，等.河南育齡女性葉酸利用能力現(xiàn)狀研究.實用檢驗醫(yī)師雜志，2012，4:6-10.

7 陸云鳳.240例孕婦在孕前、孕早期葉酸服用情況的回顧性調(diào)查分析.中國婦幼保健，2006，21:19-21.

8 張春麗，張寧.2012年玉林市農(nóng)村適齡女性孕前和孕早期葉酸服用情況調(diào)查分析.包頭醫(yī)學，2014，38:95-97.

9 陳久霞，李岐佩，姚聰，等.406例圍孕期女性葉酸服用狀況調(diào)查.中國婦幼健康研究，2013，24:432-434.

10 徐亞男，吳艷喬，呂行，等.四川省孕期女性葉酸的認知、服用狀況及影響因素分析.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2013，40:3009-3011.