培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個事項

古麗巴哈爾·斯迪克

(新疆庫爾勒市阿瓦提鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,新疆庫爾勒 841000)

培養(yǎng)基制作應(yīng)注意的幾個事項

古麗巴哈爾·斯迪克

(新疆庫爾勒市阿瓦提鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,新疆庫爾勒 841000)

培養(yǎng)基是人工制備的一種液體或固體營養(yǎng)物質(zhì),是細(xì)菌培養(yǎng)和保存細(xì)胞的基礎(chǔ)。培養(yǎng)基應(yīng)含有相應(yīng)培養(yǎng)細(xì)菌所需的營養(yǎng)成分、PH、應(yīng)無菌。培養(yǎng)基制造的基礎(chǔ)材料為水、肉浸汁(肉湯)、蛋白胨、瓊脂、明膠、酵母浸汁、鹽類和化學(xué)試劑等。然而培養(yǎng)基的質(zhì)量對生物藥品的制造、分裝及檢驗有著至關(guān)重要的作用,因此,在制作培養(yǎng)基時應(yīng)特別注意。

細(xì)菌;酶;培養(yǎng)基;酶促反應(yīng)

培養(yǎng)基是細(xì)菌的人工養(yǎng)料，根據(jù)細(xì)菌的不同要求用人工方法將各種養(yǎng)料配制在一起成為維持和繁殖細(xì)菌的基礎(chǔ)，制備適用的培養(yǎng)基，提供細(xì)菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長條件，了解其生長繁殖的規(guī)律，以提高生物制品質(zhì)量和數(shù)量，提高對病原菌分離培養(yǎng)技術(shù)。故培養(yǎng)基的質(zhì)量對生物藥品的制造，分裝及檢驗有著至關(guān)重要的作用。下面就是我在制作培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中，對常遇到的一些關(guān)鍵性問題的認(rèn)識與看法。

1 把好制作培養(yǎng)基原、輔料質(zhì)量關(guān)

制作培養(yǎng)基的基礎(chǔ)就是肉肝胃酶消化湯（浸出液），因而牛肉、牛、羊、肝、胃等基礎(chǔ)原料要選擇新鮮、無異嗅、無病變、有彈性、浸出液透明清朗，能提供豐富的營養(yǎng)成分。制備肉浸汁，除選好的材料外，浸漬方法也很重要，浸泡目的是使肉組織的水溶性營養(yǎng)物質(zhì)充分的溶解在水中。經(jīng)做過的冷浸法和熱浸法煮肉湯的對比實驗表明，冷浸法的效果要比熱浸法好，現(xiàn)多采用冷浸法。由于菌種培養(yǎng)基要求比較高。因此配制時力求使用新鮮原材料，現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證質(zhì)量。不馬上使用的肉湯等要先流通1h后送冷庫保存?zhèn)溆?。對于輔助材料，化學(xué)試劑等，都要先經(jīng)廠化驗室檢驗合格后方可使用。

2 制備血斜培養(yǎng)基應(yīng)注意的幾點

2.1 做好消毒準(zhǔn)備工作

無菌間要徹底熏蒸消毒，采血器皿、分裝物品均要先高壓消毒，以防污染。無菌操作，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。

2.2 普通瓊脂在未加血前的制作是很關(guān)鍵的

首先pH值要適宜，一般控制在8.0左右即可。另外加瓊脂時也是有要求的。我們做過加粉狀瓊脂和條狀瓊脂的對比實驗，結(jié)果加粉狀瓊脂的培養(yǎng)基加血后不溶血，呈片狀，不能用。而加條狀瓊脂的加血后溶血，效果較好。因而制作鮮血瓊脂培養(yǎng)基時，都采用條狀瓊脂。

2.3 普通瓊脂加血前要徹底消毒

待溫度降至48～50℃時，加入采好的羊血，這樣既不至于溫度太高破壞血成分，也不至于溫度太低以至凝固，不能分裝。所以控制好溫度比較重要。

3 注意控制好培養(yǎng)基的最終pH

（1）細(xì)菌在培養(yǎng)基中分裂繁殖除溫度、空氣、營養(yǎng)條件外，對pH的反應(yīng)也很敏感。酸堿度不適宜即便營養(yǎng)最豐富的培養(yǎng)基，細(xì)菌也不能很好地生長繁殖，或根本不發(fā)育。因而制備培養(yǎng)基必須正確測定pH。一般測定法有：①試紙測定法，此法簡單方便，但有誤差。②比色管測定法，現(xiàn)普遍采用此法。

（2）pH測定最重要的是防止反復(fù)加酸加堿，最好一次加妥。因為反復(fù)加酸加堿會增加培養(yǎng)基中氯化鈉含量，鹽含量太高會使?jié)B透壓失去平衡而造成細(xì)菌的死亡，而且反復(fù)加酸加堿易使培養(yǎng)基發(fā)生渾濁和沉淀。為避此現(xiàn)象發(fā)生，采取加堿量計算的方法防止盲目加堿?？尚≡?000ml加堿量，從而推算全部加堿量。另外還應(yīng)注意以下幾點：

①標(biāo)準(zhǔn)管必須準(zhǔn)確，定期用電比校對。

②被測溶液和培養(yǎng)基的溫度不能太高或太低，因為指示劑在培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)與溫度有關(guān)。為真實反應(yīng)培養(yǎng)基的pH值，測時溫度應(yīng)在20～25℃左右近于體溫。

③比色管要顏色、厚薄、粗細(xì)必須一致。

④加指示劑的吸管和滴管應(yīng)避免與培養(yǎng)基接觸，否則培養(yǎng)基進(jìn)入指示劑內(nèi)，造成指示劑反應(yīng)顏色不準(zhǔn)，影響結(jié)果。

⑤觀察時應(yīng)在自然光下觀察，避免直對著太陽光和燈光。

4 控制好消毒溫度

培養(yǎng)基的消毒是否徹底是很關(guān)鍵的，消毒溫度和時間是保證培養(yǎng)基質(zhì)量的重要一環(huán)，既要達(dá)到滅菌目的，又要保證各種營養(yǎng)成分不受或少受破壞。一般培養(yǎng)基消毒都是116℃，20～30min，而特殊培養(yǎng)基（如糖類培養(yǎng)基、石蕊牛奶培養(yǎng)基等）就有些特殊之處。溫度太高會導(dǎo)致糖分解產(chǎn)酸。以前曾多次發(fā)生過沖塞、變色等現(xiàn)象，后經(jīng)幾次實踐，確定最佳消毒方案即110℃，20min，而且上下磅不能太快，以后很少再出現(xiàn)此類事情。

5 制作消化湯時應(yīng)注意的事項

消化湯在培養(yǎng)基制作時應(yīng)用非常普遍，無論是豬胃消化湯還是肉肝胃酶消化湯以及胰酶消化湯，其實質(zhì)都是酶促反應(yīng)。因此要想消化徹底，必須掌握影響酶促反應(yīng)速度的因素。

5.1 溫度對酶促反應(yīng)的影響

酶是蛋白質(zhì)，消化溫度太高會使酶變性失活。酶的最適溫度是酶的反應(yīng)速度達(dá)到最高峰的溫度，一般最適宜溫度為40～50℃，60℃以上即開始變性失活。經(jīng)多次實踐，認(rèn)為豬胃消化湯最適宜溫度為50～53℃，肉肝胃酶消化湯是56～58℃，消化液較清朗、徹底。

5.2 pH對酶促反應(yīng)的影響

酶的活性受所在環(huán)境pH影響，溶液pH不同，酶的活性也不同。在其它條件不變時，酶在一定的pH范圍內(nèi)活性最高，此pH為最適PpH，胃蛋白酶最適pH為1.5～2.5，我們一般控制在1.6～2.0，胰蛋白酶最適pH為7.8～8.4。因而無論搞豬胃消化湯還是肉肝胃酶消化湯都要加鹽酸，根據(jù)經(jīng)驗，豬胃消化湯按1%加，肉肝胃酶消化湯按1.2～1.3%量加，測pH為1.8～2.0為宜。

5.3 底物濃度對酶促反應(yīng)的影響

底物濃度與反應(yīng)速度之間存在一定的函數(shù)關(guān)系。肉、肝、胃均為底物，因而要控制好底物與水的比例。一般配制豬胃液的比例是：豬胃：蒸餾水＝3：10，如果用于計數(shù)或選菌最好是3.5～10。肉肝胃酶消化湯比例為：新鮮牛肉2kg，新鮮豬肝0.5kg蒸餾水10000ml。

5.4 酶濃度對酶促反應(yīng)的影響

當(dāng)其他條件相同時，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比。肉肝胃酶消化湯中加胃蛋白酶0.4～0.5%。豬胃消化酶大多存在于腺體所分泌的消化液中，不需要另加，如胃質(zhì)量差可適當(dāng)加些胃蛋白酶促進(jìn)消化。

5.5 消化時間

規(guī)程規(guī)定胃18～24h，視消化而定。一般我們消化22～24h便停止消化，視湯清朗為宜。抽取上清加熱煮沸，按2.5～3.0%量加入2N氫氧化鈉溶液調(diào)pH達(dá)3.8左右，停止消化，湯備用。

以上就是培養(yǎng)基在制作時的幾個問題，以及影響消化湯消化程度和速度的幾個因素。

[1] 王樹成.制作培養(yǎng)基過程中應(yīng)注意的幾個問題[J].天津畜牧獸醫(yī)，1993，（1）：40.

[2] 孔怡，蔚承祥，鄭錚.如何提高制作母種培養(yǎng)基的質(zhì)量[J].食用菌，2009，31（1）：27-28.