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    HPLC、HPLC-MS在經(jīng)方成分分析及Co-IP、激光共聚焦在經(jīng)方藥理機(jī)制研究中的應(yīng)用

    2015-04-03 20:51:28陳向陽(yáng)玄子男李宇航
    世界中醫(yī)藥 2015年1期
    關(guān)鍵詞:經(jīng)方質(zhì)譜蛋白

    吳 瑩 陳向陽(yáng) 玄子男 李宇航

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

    經(jīng)方指《傷寒論》和《金匱要略》所記載之方劑。經(jīng)方具有用藥精當(dāng)、劑量準(zhǔn)確;組方嚴(yán)謹(jǐn)、配伍巧妙;劑型豐富、煎服有法;加減靈活、功效卓著等特點(diǎn),為歷代醫(yī)家進(jìn)行方劑研究的首選對(duì)象[1]。然而,經(jīng)方的現(xiàn)代研究同樣面臨藥理作用機(jī)制復(fù)雜、有效成分不明確等問(wèn)題,從而制約了經(jīng)方在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的推廣以及國(guó)際化的進(jìn)程。因此,憑借現(xiàn)代藥學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)手段,從經(jīng)方主要活性成分的鑒定、藥理作用的分子機(jī)制等方面揭示經(jīng)方的作用機(jī)制,是經(jīng)方現(xiàn)代研究的重要關(guān)節(jié)之一?;诖耍覀?cè)诒疚膶⒔榻B高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography,HPLC)相關(guān)技術(shù)在經(jīng)方成分鑒定,以及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)、激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方藥理作用機(jī)制研究方面的應(yīng)用及思路。

    1 HPLC及高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)在經(jīng)方現(xiàn)代研究中的應(yīng)用

    現(xiàn)代藥理學(xué)研究需要明確藥物成分、含量以及質(zhì)控。HPLC及其相關(guān)技術(shù)是以液體作為流動(dòng)相,采用高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測(cè)器發(fā)展而成的一種分離分析方法,由于具有準(zhǔn)確快速等優(yōu)勢(shì),常用于檢測(cè)藥物的主要成分及含量,是藥物分析研究中關(guān)鍵的質(zhì)控技術(shù)。HPLC憑借其高效、高速、可分離大多數(shù)液體樣品等優(yōu)勢(shì),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物的含量測(cè)定[2-3]、成分分析[4-5]、質(zhì)量控制[6-7]等方面。同時(shí),利用HPLC的高分離效能和質(zhì)譜技術(shù)(MS)的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn),將HPLC與MS聯(lián)合使用,更加有利于準(zhǔn)確分析藥物組分[8-9]。HPLC及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)越性,使其廣泛被應(yīng)用到經(jīng)方成分及含量的鑒定中。經(jīng)方的HPLC、HPLC-MS分析涉及經(jīng)方樣品的前處理、經(jīng)方成分的定量分析、定性分析以及經(jīng)方的藥物代謝研究等方面。

    1.1 經(jīng)方樣品的前處理 經(jīng)方湯劑是我國(guó)應(yīng)用最早、最廣泛的一種劑型,是將加工炮制或未經(jīng)炮制的藥材納入飲用水(或其他專用水)中浸泡,再經(jīng)煎煮去渣取汁制成的液體制劑[10]。煎煮法是我國(guó)中藥復(fù)方傳統(tǒng)的提取方法,也是現(xiàn)代經(jīng)方研究過(guò)程中最常采用的提取方法。煎煮方法直接影響到藥物有效成分的溶出量,不同經(jīng)方煎煮方式會(huì)有所不同,需高度重視。魏惠珍等[11]將大黃36 g,厚樸27 g,枳實(shí)27 g,芒硝13.5 g浸泡在8倍量水中30 min,加熱煮沸后,文火慢煎40 min,放冷,紗布濾過(guò)得大承氣湯,用于大承氣湯HPLC指紋圖譜的研究。胡俊輝[12]稱取干姜、黃芩、黃連、人參各75 g,加10倍量的水浸泡2 h后,煎煮1 h,濾過(guò)再煎煮兩次,合并濾液,濃縮定容至2000 mL作為水煎液;采用RP-HPLC測(cè)定干姜黃芩黃連人參水煎液的11種藥效成分。

    隨著科技的發(fā)展與科研的需要,許多新技術(shù)、新方法如超聲提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、微波萃取法等被應(yīng)用到中藥化學(xué)成分提取中,其中超聲提取法也常被用于經(jīng)方有效成分的提取,尤其在經(jīng)方丸劑樣品溶液制備方面,更顯其重要性。如郭琪等[13]精密稱取麻仁潤(rùn)腸丸樣品0.5 g,加甲醇25 mL,稱重,超聲(100W,45kHz)30 min,再用甲醇補(bǔ)足重量,搖勻?yàn)V過(guò)即得麻仁潤(rùn)腸丸供試品溶液。李冬梅等[14]采用超聲提取法得止嗽定喘丸溶液,又通過(guò)固相萃取技術(shù)凈化處理樣品,用于止嗽定喘丸中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量的測(cè)定。

    1.2 HPLC及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在經(jīng)方成分分析中的應(yīng)用 經(jīng)方藥物組成變化多樣,所含化學(xué)成分類型眾多,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,數(shù)目龐大。如何將現(xiàn)代化的成分分析手段與現(xiàn)有的提取技術(shù)相結(jié)合,對(duì)于經(jīng)方有效成分的分離分析至關(guān)重要,而HPLC法及HPLCMS可以實(shí)現(xiàn)多種成分分離分析,展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

    1.2.1 經(jīng)方定量分析 由于HPLC具有簡(jiǎn)便、快速、大大提高檢測(cè)效率等特點(diǎn),已在經(jīng)方研究中占據(jù)著重要的地位。HPLC通過(guò)定量分析經(jīng)方的多種化學(xué)成分,可確定經(jīng)方有效成分的含量、分析經(jīng)方配伍效應(yīng)、實(shí)現(xiàn)經(jīng)方用藥的多指標(biāo)質(zhì)量控制,為經(jīng)方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。HPLC定量分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度還可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)偏差、日內(nèi)以及日間精密度來(lái)衡量。毛瑩等[15]利用 HPLC法,采用色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm),3種不同的流動(dòng)相,4種梯度洗脫方法分別對(duì)葛根芩連湯中葛根素、大豆苷、大豆苷元,黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素,鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿,甘草酸銨、甘草苷進(jìn)行了含量測(cè)定。堯愛(ài)珉等[16]采用HPLC法對(duì)梔子大黃湯中的9種特征成分進(jìn)行定量測(cè)定,并分析該經(jīng)方配伍前后成分的變化。實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-UV測(cè)定該經(jīng)方水煎液中梔子苷、柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷的含量測(cè)定方法,結(jié)果顯示梔子大黃湯全方配伍能夠增加梔子苷及三種黃酮苷的含量;該實(shí)驗(yàn)又采用HPLC-DAD法對(duì)梔子大黃湯中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚進(jìn)行含量測(cè)定,發(fā)現(xiàn)枳實(shí)-大黃配伍可以增加五種蒽醌化合物的含量。朱繼孝等[17]建立HPLC-DAD法對(duì)梔子柏皮湯中梔子苷、甘草苷、西紅花苷-I、鹽酸藥根堿、西紅花苷-Ⅱ、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和甘草酸8種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定,為該復(fù)方的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供依據(jù)。劉晶晶等[18]采用反相HPLC法對(duì)三黃瀉心湯中生物堿類、黃酮類、游離蒽醌類、結(jié)合蒽醌類等四大類成分共16個(gè)藥效組分進(jìn)行了含量測(cè)定,為中藥藥效組分質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立提供了科學(xué)依據(jù)。

    1.2.2 經(jīng)方定性分析 經(jīng)方化學(xué)成分復(fù)雜,其間往往存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系,這正是經(jīng)方發(fā)揮療效的基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)經(jīng)方復(fù)雜成分體系中主要成分的定性分析,對(duì)于進(jìn)一步揭示藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有著重要的意義。HPLC法不僅在有效成分含量測(cè)定方面展現(xiàn)了較高分析能力,而且在化學(xué)成分定性分析中也占據(jù)重要的地位。HPLC法利用樣品和對(duì)照品比對(duì)的方法進(jìn)行定性分析,方法簡(jiǎn)單,但必須是已知物,而將HPLC與質(zhì)譜聯(lián)用可以克服定性分析時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的依賴,可作為化學(xué)成分分析簡(jiǎn)便準(zhǔn)確可靠的方法。采用HPLC-MS可以在線獲取樣品中各化合物的多級(jí)質(zhì)譜,通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的多級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行比較,或分析對(duì)照已知化合物的多級(jí)質(zhì)譜圖[19],可迅速對(duì)經(jīng)方化學(xué)成分進(jìn)行快速分析鑒別。汪航等[20]采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),分析鑒定出梔子大黃湯中的20個(gè)化合物,包括黃酮類、蒽醌類以及環(huán)烯醚萜類等。Qin等[21]采用 HPLC-ESI-MS分析方法對(duì)百合知母湯中的主要成分進(jìn)行了鑒定;在正、負(fù)離子模式下獲得化合物的分子量信息,通過(guò)比對(duì)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及對(duì)照品質(zhì)譜裂解信息,鑒定出了38個(gè)化學(xué)成分,包括4個(gè)酚酸糖苷、3個(gè)黃酮和31個(gè)皂苷。

    通過(guò)將經(jīng)方有效成分提取液質(zhì)譜圖與組成該方各單味藥提取液質(zhì)譜圖相對(duì)比,可對(duì)各成分的藥材來(lái)源進(jìn)行歸屬。Xu等[22]建立了HPLC-ESI/MS/MS分析了大承氣湯組分的分析方法,采用反相C18色譜柱,梯度洗脫,負(fù)離子掃描模式,共鑒定出30個(gè)化合物;通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì),確定了14個(gè)化合物,包括2個(gè)單寧酸、3個(gè)蒽醌、2個(gè)番瀉苷、5個(gè)黃酮、2個(gè)木脂素;通過(guò)與大黃、枳實(shí)、厚樸等單味藥提取液的質(zhì)譜對(duì)比,發(fā)現(xiàn)單寧酸、蒽醌和番瀉苷來(lái)源于大黃,黃酮來(lái)源于枳實(shí),木脂素來(lái)源于厚樸。王海燕等[23]采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同制法四逆湯中的化學(xué)成分進(jìn)行了定性鑒別,共定性出傳統(tǒng)水提液28個(gè)化學(xué)成分,其中14個(gè)化學(xué)成分來(lái)自黑附子,7個(gè)化學(xué)成分來(lái)自干姜,余下7個(gè)化學(xué)成分來(lái)自炙甘草;有效部位組合液中30個(gè)化學(xué)成分,其中14個(gè)化學(xué)成分來(lái)自黑附子,8個(gè)化學(xué)成分來(lái)自干姜,8個(gè)化學(xué)成分來(lái)自炙甘草。楊楠等[24]為確定芍藥散中鎮(zhèn)痛活性部位中2個(gè)新化合物的來(lái)源,采用HPLC-MS/MS技術(shù),正離子掃描,檢測(cè)方式為一級(jí)質(zhì)譜掃描,子離子掃描和多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè),對(duì)該經(jīng)方的6個(gè)組分藥材分別進(jìn)行檢測(cè),并以2個(gè)新化合物為對(duì)照品,最終確定二者均來(lái)源于白術(shù)。

    1.3 HPLC及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在經(jīng)方藥物代謝中的應(yīng)用 經(jīng)方是一個(gè)的復(fù)雜體系,其藥效作用并不簡(jiǎn)單的依賴于復(fù)方中已知化學(xué)成分產(chǎn)生,也可能來(lái)源于代謝產(chǎn)物。藥物代謝就是研究藥物進(jìn)入體內(nèi)后,在體液、酶等的作用下發(fā)生生化反應(yīng)的過(guò)程,其研究?jī)?nèi)容包括代謝物的分離、鑒定、代謝途徑的追蹤、體內(nèi)體外代謝的比較以及痕量分析測(cè)定[25]。經(jīng)方本身化學(xué)成分的復(fù)雜性以及經(jīng)方藥物代謝成分的未知性,對(duì)于探明復(fù)方中發(fā)揮療效的成分具有一定的挑戰(zhàn)性,但是現(xiàn)代分析技術(shù)和儀器的發(fā)展為經(jīng)方藥物代謝研究提供了有力武器。HPLC及HPLC-MS技術(shù)不僅可以定量分析中藥復(fù)方有效成分及代謝物在體內(nèi)的含量變化,而且可以定性分析代謝成分。

    隨著藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的不斷深入,探明經(jīng)方有效成分的血清藥物濃度與藥理作用之間的關(guān)系也逐漸成為必不可少的環(huán)節(jié)。HPLC可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血液中有效成分的含量測(cè)定,進(jìn)而獲得血藥濃度;再以血藥濃度為指標(biāo),采用藥動(dòng)學(xué)軟件擬合血藥濃度-時(shí)間曲線,以此來(lái)反應(yīng)中藥復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律。陳月鳳等[26]采用HPLC法建立了大鼠灌胃給予葛根芩連微丸后血漿中葛根素、黃芩苷和小檗堿的濃度變化并繪制出血藥濃度-時(shí)間曲線,為進(jìn)一步開(kāi)展葛根芩連方制劑有效成分的血藥濃度與藥理作用提供參考依據(jù)。高宇勤等[27]采用HPLC技術(shù)測(cè)定當(dāng)歸四逆湯中肉桂酸和甘草酸在大鼠血清中的變化,并利用3P97軟件計(jì)算這2種化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)肉桂酸和甘草酸吸收都比較快,但前者代謝較快,在體內(nèi)滯留時(shí)間短。該課題組又研究了當(dāng)歸四逆湯中阿魏酸在大鼠血清中的含量變化;采用HPLC方法,通過(guò)外標(biāo)法測(cè)定其血藥濃度,發(fā)現(xiàn)大鼠口服當(dāng)歸四逆湯后,阿魏酸吸收較快,但是消除慢[28]。

    HPLC-MS具有速度快、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)限低以及高定性能力等優(yōu)點(diǎn),已然是經(jīng)方藥物代謝研究的理想工具。徐衛(wèi)東等[29]采用HPLC-MS/MS法,對(duì)大鼠灌胃給予四逆散后血清中有效成分進(jìn)行定性鑒別;結(jié)果共鑒定出芍藥苷、柚皮素、甘草苷、橙皮苷、橙皮素、甘草酸、柴胡皂苷d等7個(gè)原型成分,同時(shí)還檢測(cè)出甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸、橙皮素葡萄糖醛酸等代謝產(chǎn)物。

    總之,運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)開(kāi)展經(jīng)方藥物研究,對(duì)于經(jīng)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)、揭示經(jīng)方配伍效應(yīng)、闡明經(jīng)方的作用機(jī)制,指導(dǎo)臨床規(guī)范化應(yīng)用具有重要的意義。HPLC法應(yīng)用于經(jīng)方化學(xué)成分的分離分析,既簡(jiǎn)便又準(zhǔn)確可靠,而且將HPLC的高分辨能力與質(zhì)譜的強(qiáng)定性能力相結(jié)合,可以獲得更多的化合物含量和結(jié)構(gòu)信息。HPLC-MS對(duì)難以辨別的痕量化合物依然擁有較高的定性定量分析能力,其在今后的經(jīng)方研究中的地位必將大大提升。

    2 免疫共沉淀及激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方現(xiàn)代藥理學(xué)研究中的應(yīng)用

    在經(jīng)方的藥理作用機(jī)制研究方面,常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫法等可用于檢測(cè)可溶性蛋白的濃度、western blot用于半定量檢測(cè)蛋白、PCR及熒光定量PCR檢測(cè)DNA及mRNA水平、免疫組化檢測(cè)蛋白在組織或細(xì)胞中的分布。以上方法分別在基因及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)經(jīng)方對(duì)于信號(hào)通路關(guān)鍵分子及目的蛋白的影響以明確經(jīng)方的作用機(jī)制。然而,經(jīng)方的成分復(fù)雜,且基于中醫(yī)“整體觀”的理論基礎(chǔ),其藥理作用機(jī)制有“多靶點(diǎn)”“整體調(diào)節(jié)”的特點(diǎn)。因此,其作用特點(diǎn)可能不僅局限于對(duì)某個(gè)、某幾個(gè)蛋白的影響,而體現(xiàn)在對(duì)蛋白與蛋白之間、蛋白與核酸之間作用的影響。基于此,越來(lái)越多的中醫(yī)藥研究者開(kāi)始重視免疫共沉淀技術(shù)在經(jīng)方藥理作用研究中的應(yīng)用。同時(shí),大量研究表明,經(jīng)方的藥理作用可能表現(xiàn)在對(duì)關(guān)鍵分子的細(xì)胞內(nèi)定位、轉(zhuǎn)移的影響,因此,激光共聚焦技術(shù)也被廣泛地應(yīng)用于經(jīng)方的藥理機(jī)制研究中。筆者將結(jié)合課題組的研究,介紹免疫共沉淀及激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方現(xiàn)代藥理研究中的應(yīng)用。

    2.1 免疫共沉淀技術(shù)在經(jīng)方藥理機(jī)制研究中的應(yīng)用 免疫共沉淀技術(shù)是一門以抗原和抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的研究目的蛋白和與其結(jié)合的大分子物質(zhì)相互作用的技術(shù)。該技術(shù)主要用于蛋白質(zhì)鑒定,還可應(yīng)用于RNA和DNA鑒定等。該技術(shù)主要研究的是自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)間相互作用,作用對(duì)象為天然蛋白,前提需要已知目的蛋白。主要操作步驟分為細(xì)胞裂解,標(biāo)簽蛋白與目的蛋白結(jié)合,形成蛋白質(zhì)復(fù)合體,清洗,洗脫,分離蛋白。

    目前常用蛋白檢測(cè)技術(shù)如Western blotting、免疫組化技術(shù),主要針對(duì)某種特定蛋白,分析目標(biāo)過(guò)于局限,脫離了整體環(huán)境,而免疫共沉淀則針對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物,側(cè)重于大分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用,不再局限于一個(gè)單獨(dú)的靶點(diǎn),通過(guò)捕獲復(fù)合物分析蛋白質(zhì)調(diào)控的過(guò)程。目前主要應(yīng)用于腫瘤研究、酶與病毒研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究和寄生蟲研究等[30-31]。根據(jù)大分子物質(zhì)不同,分為:

    1)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物,這是最常見(jiàn)的免疫共沉淀,分離復(fù)合物后,聯(lián)合WB實(shí)驗(yàn),對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,如利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證 SET與eEF1A1在人肝細(xì)胞內(nèi)的相互作用,推斷SET蛋白可能在三氯乙烯致癌的作用機(jī)制中起著重要作用[32]。

    2)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,又稱為染色質(zhì)免疫共沉淀,分離復(fù)合物得到的DNA序列分別通過(guò)PCR技術(shù)、測(cè)序分析和芯片技術(shù)等進(jìn)行序列分析,如通過(guò)免疫共沉淀驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)HIF-1與Id-1啟動(dòng)子的結(jié)合部位[33]。

    3)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,分離復(fù)合物后RNA序列驗(yàn)證方法同DNA類似,如免疫共沉淀與基因芯片技術(shù)聯(lián)合建立一種RNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)的鑒定方法[34]。另一方面,免疫共沉淀技術(shù)不僅可以驗(yàn)證某種復(fù)合物的存在,還可以發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合物質(zhì)或作用方式,如運(yùn)用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜篩選肝核因子HNF3β相互作用蛋白質(zhì),尋找生理水平下新的蛋白復(fù)合體[35]。

    中藥藥理學(xué)主要研究中藥作用于機(jī)體的機(jī)制和機(jī)體對(duì)于藥物的代謝。目前中藥復(fù)方(包括經(jīng)方)的作用機(jī)制成為中藥藥理學(xué)的研究熱點(diǎn),而其在機(jī)體作用過(guò)程復(fù)雜,特點(diǎn)為多靶點(diǎn)、多成分、多途徑。如果僅僅運(yùn)用WB和免疫組化技術(shù),已滿足不了中藥藥理機(jī)制的研究,免疫共沉淀技術(shù)如今已逐步運(yùn)用于中藥復(fù)方分子機(jī)制的研究,如研究調(diào)心方對(duì)動(dòng)物阿爾茨海默病相關(guān)tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)及其可能的作用機(jī)制,利用免疫共沉淀驗(yàn)證早老蛋白-1與其靶點(diǎn)tau蛋白的結(jié)合,確定兩種蛋白的確相互作用[36]。同時(shí),免疫共沉淀與芯片技術(shù)聯(lián)合,作為一種高通量研究技術(shù),恰恰為經(jīng)方復(fù)方分子機(jī)制研究提供了可行的方法。

    當(dāng)然,免疫共沉淀技術(shù)仍有其局限性,一方面檢測(cè)的是蛋白質(zhì)粗體物,驗(yàn)證兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用不能確定為直接作用,另一方面,實(shí)驗(yàn)具有一定的冒險(xiǎn)性,用于免疫共沉淀的抗體選擇要慎重,以免出現(xiàn)假陽(yáng)性,或無(wú)反應(yīng)。

    2.2 激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方藥理機(jī)制研究中的應(yīng)用 激光共聚焦技術(shù)是利用激光束透過(guò)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,被照射點(diǎn)在探測(cè)針孔出成像,通過(guò)光電倍增管或冷電耦器件接收,迅速在電腦屏幕上成像。由于照明針孔和探測(cè)針孔對(duì)于被照射點(diǎn)是共軛的,焦平面上的點(diǎn)可以同時(shí)在照明針孔和探測(cè)針孔處成像,焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)成像。該技術(shù)克服了普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)時(shí)被檢測(cè)點(diǎn)收到附近相鄰點(diǎn)的干擾的缺點(diǎn),可以形成清楚地光學(xué)橫斷面,圖像準(zhǔn)確清晰,能進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),同時(shí)結(jié)合Z軸掃描還能做出三維成像。

    激光共聚焦常常用于蛋白質(zhì)檢測(cè),為了提高分辨率和獲得高對(duì)比度圖像,一般需先使用帶有特殊熒光標(biāo)記的抗體孵育染色,再?zèng)_洗后進(jìn)行激光共聚焦檢測(cè)。如有需要,可以進(jìn)行活體染色,還可同時(shí)直接進(jìn)行兩色,甚至三色染色,當(dāng)然,多色染色時(shí)需注意選取熒光波長(zhǎng)差別較大的染料。筆者的課題中,曾對(duì)細(xì)胞中F-actin、細(xì)胞膜和ERM蛋白同時(shí)進(jìn)行染色,從而分析經(jīng)方對(duì)病毒感染的細(xì)胞中F-actin與ERM蛋白在細(xì)胞中分布的影響[37]。而免疫組化法無(wú)法觀察正常生理狀態(tài)下的組織形態(tài),且進(jìn)行復(fù)染時(shí)常常會(huì)引起顏色覆蓋,或顏色交叉后變色等問(wèn)題。另一方面,共聚焦技術(shù)不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定位監(jiān)測(cè),如分析目標(biāo)蛋白在細(xì)胞或組織中的分布,通過(guò)檢測(cè)角蛋白和波形蛋白的表達(dá)可以進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞的鑒定[38],還可借助圖片分析軟件選取顯色部位面積求和,或統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度,進(jìn)行定量檢測(cè),同時(shí)兼顧了免疫組化與WB實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn);不僅可以應(yīng)用于體內(nèi)試驗(yàn),對(duì)組織進(jìn)行染色,還可應(yīng)用于體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞染色。激光共聚焦技術(shù)不僅可以檢測(cè)蛋白質(zhì),還可實(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+、pH值及其他細(xì)胞內(nèi)離子[39]。張麗萍等研究加味溫膽湯對(duì)抑郁型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響,采用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)Ca2+濃度變化情況,發(fā)現(xiàn)加味溫膽湯可能通過(guò)抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞鈣離子大量?jī)?nèi)流,發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)[40]。

    激光共聚焦目前已應(yīng)用于中藥組織化學(xué)研究,如對(duì)白芷根中香豆素類成分的定位和定量研究[41],還應(yīng)用于中藥藥效學(xué)和藥理學(xué)研究,如用于中藥與天然藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究,觀察細(xì)胞核變化與凋亡小體、觀察線粒體膜電位變化、觀測(cè)活性氧自由基含量等,或?qū)咕兴幊煞诌M(jìn)行機(jī)制研究[42]。其應(yīng)用前景并不僅僅局限于上述方向,利用其實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能,可以將其運(yùn)用于藥物代謝動(dòng)力學(xué),或者用于分析藥物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

    3 討論

    綜上所述,免疫共沉淀技術(shù)可用于研究經(jīng)方對(duì)蛋白之間相互作用的影響,激光共聚焦技術(shù)可觀察經(jīng)方不同蛋白、離子的分布、轉(zhuǎn)位及含量的影響,結(jié)合常規(guī)核酸、蛋白定量技術(shù)以及免疫共沉淀、激光共聚焦可較為全面地分析經(jīng)方對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的影響,從而分析經(jīng)方藥理作用的分子機(jī)制;HPLC及HPLC-MS是目前最常用的藥理成分分析及質(zhì)量控制的技術(shù),同樣適用于經(jīng)方成分的鑒定及分析,在經(jīng)方藥理機(jī)制研究基礎(chǔ)上結(jié)合經(jīng)方主要活性成分的分析,可使經(jīng)方的臨床應(yīng)用得到國(guó)內(nèi)外同行的認(rèn)可,有利于經(jīng)方的推廣和應(yīng)用。

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