腫瘤診斷的新希望
—循環(huán)游離DNA檢測

黎四維　韓露　馬培　周新

腫瘤診斷的新希望
—循環(huán)游離DNA檢測

黎四維韓露馬培周新

作者單位：430071武漢市，武漢大學中南醫(yī)院基因診斷中心

游離DNA是指游離于細胞之外的一類DNA，又稱為循環(huán)核酸，1947年由Mandel和Métais發(fā)現(xiàn)。腫瘤患者外周血DNA水平高于正常人，且血液中游離DNA具有腫瘤細胞DNA的特征。隨著腫瘤分子生物學的深入研究，血液中游離DNA定量分析已開始應用于腫瘤的早期診斷、個體化治療和預后判斷等。本文從游離DNA的來源、特點、提取、檢測及臨床應用方面對游離DNA及其在腫瘤中的重要作用做一綜述。

游離DNA；基因檢測；腫瘤

doi：10.3969/j.issn.1674-7151.2015.02.014

游離DNA是一種游離于血液或體液中的DNA。1947年，Mandel和Métais［1］首次報道了外周血中存在游離DNA，但這一發(fā)現(xiàn)并沒引起足夠的重視。在隨后30多年的時間中，人們先后在自身免疫性疾病和腫瘤中發(fā)現(xiàn)了游離DNA的存在。1994年，Vasioukhin［2］和Sorenson［3］等在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征和胰腺癌患者外周血游離DNA中發(fā)現(xiàn)了RAS基因的突變，這一發(fā)現(xiàn)才引起人們足夠的重視。1996年，Nawroz等［4］又在腫瘤患者血漿游離DNA中發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星改變。隨著新的研究結果的不斷出現(xiàn)，醫(yī)學界對于腫瘤患者游離DNA的關注越來越多。

檢測血漿或血清中游離DNA可視為一種“液體活檢”，有益于開展各種相關診斷，并能避免對腫瘤組織活檢的需要。以血液為檢測標本，使重復采集檢測樣本成為了可能，從而有利于對疾病的發(fā)展及腫瘤的治療過程進行跟蹤監(jiān)測。雖然游離DNA同時反映了生理和病理過程，并非腫瘤特異性，但自從發(fā)現(xiàn)血液游離DNA含有腫瘤細胞DNA相同基因突變后，其在腫瘤的早期診斷、預后評估、療效監(jiān)測等方面的潛在價值越來越受到關注。本文就游離DNA的來源、生物學特性、檢測方法及其在腫瘤診斷中的臨床應用做一綜述。

1　游離DNA的來源及其特點

在健康人體內，血漿中可以發(fā)現(xiàn)少量的游離DNA，片段主要在185～200 bp或其整數(shù)倍。健康人血漿中的游離DNA主要來源于凋亡細胞。除此之外，所有的活細胞都自發(fā)性的向血液中釋放DNA片段，這些DNA片段又稱為代謝性DNA片段。對于腫瘤患者外周血中游離DNA的來源，人們提出了幾種假設。腫瘤微環(huán)境中癌細胞凋亡和壞死后釋放是其主要來源。腫瘤細胞主動分泌可能是其另一個潛在的來源。壞死和凋亡細胞主要被巨噬細胞或其他清道夫細胞吞噬。巨噬細胞吞噬壞死細胞后可以釋放消化的DNA到組織環(huán)境。體外的細胞培養(yǎng)實驗［5］結果表明，巨噬細胞在釋放DNA的過程中可被激活或死亡，但細胞核酸的片段仍可以釋放到外周血中。血液中循環(huán)的腫瘤細胞以及轉移到骨髓或肝臟等處的腫瘤細胞也可以釋放出游離DNA，其大小主要分布在70～200 bp，大的片段則可達到10 000 bp以上。

血漿中腫瘤細胞釋放出游離DNA的多少，取決于腫瘤的性質、大小等。此外，血液中游離DNA的含量也受到血液及淋巴循環(huán)對其清除、降解等的影響。血液中的游離DNA由肝臟和腎臟清除，其半衰期從15 min到幾個小時不等。有研究［6］顯示，某些形式的DNA較其他形式的半衰期更長。把純化的DNA注入小鼠血液中，結果顯示雙鏈DNA較單鏈DNA在血液中存在的時間更長，環(huán)狀的病毒DNA較線性DNA存活時間更長。然而，不論片段大小及形態(tài)，游離DNA都能被快速有效的從血液中清除。

2　游離DNA的提取及其檢測方法

不同的實驗室提取游離DNA的方法各有不同，也有許多商品化的試劑盒可供使用，但目前并沒有公認的標準提取方法和純化步驟。許多試劑盒也沒有對樣本的分離、處理、分析進行明確的說明。目前，主要的提取方法有離子交換樹脂法、鹽析法和磁珠分離法等。

目前，對于采用血漿還是血清作為游離DNA提取的最佳樣本仍然存在爭議。由于不同實驗室采用不同的試劑和提取方法，因而無法對各實驗室間的提取結果進行比較。從血漿中分離得到游離DNA較血清中少，這可能是因為凝血可以促使白細胞釋放游離DNA。這種由白細胞釋放的DNA對游離NDA的定量或突變等的檢測均有影響。

游離DNA的定量檢測目前尚無統(tǒng)一的操作標準，不同實驗室間的檢測方法也很難達到一致。各種分析前因素，如血液的處理延遲、凝固、凍融、儲存溫度、患者的基本情況等均會對游離DNA的含量及完整性有很大的影響。長時間的儲存，也會影響游離DNA的含量，Sozzi等［7］的實驗結果顯示，血漿或DNA儲存在-80℃一年后，其DNA含量可下降約30%。但無論采用何種方法，如熒光為基礎的方法（如PicoGreen染色和紫外光譜法）或定量PCR法（如SYBR Green和TaqMan探針），均可檢測到腫瘤患者游離DNA較正常對照者升高［8］。

游離DNA的定性檢測按研究對象和目的不同可采用不同的方法，主要有單鏈構象多態(tài)性分析聚合酶鏈反應法、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應法、測序分析和特異性引物延伸法，上述方法主要用于游離DNA未知突變的篩查、基因的遺傳多態(tài)性分析、分析有無對應的已知突變等。如果采用游離DNA作為腫瘤診斷、預后評估及療效監(jiān)測的生物標志物，進行更多大樣本、多中心的臨床研究并建立標準化的檢測方法是很有必要的。

3　游離DNA的臨床應用

3.1游離DNA突變檢測檢測游離DNA中腫瘤特異性的基因突變具有較好的臨床價值，如KRAS和TP53等這些在多種類型腫瘤中具有高突變頻率的基因，其檢測對腫瘤的早期診斷具有重要的臨床意義。最近的一項研究［9］通過大規(guī)模的芯片篩查顯示，PIK3CA、TP53和GATA3三個基因突變占到全部乳腺癌基因突變的10%以上，其中Luminal A型乳腺癌最常見的突變?yōu)镻IK3CA基因（45%），其次是MAP3K1，GATA3、TP53、CDH1和MAP2K4。Luminal B型乳腺癌中TP53和PIK3CA基因突變均占總突變的29%；HER2E亞型乳腺癌中HER2基因擴增達80%，此外TP53和PIK3CA的突變分別為72%和39%；basal-like型乳腺癌中TP53突變則達到80%以上。

針對游離DNA突變的檢測，需要突變位點在腫瘤具有以下特點：發(fā)生頻率高并具有腫瘤特異性。但是，突變往往發(fā)生頻率較低。此外，還應考慮到正常細胞所釋放的DNA造成的干擾。通過血液游離DNA相對高發(fā)的基因突變的檢測，可以對相應疾病進行預警，并有利于進一步對疾病進行分型。

3.2腫瘤特異性的微衛(wèi)星改變游離DNA中發(fā)現(xiàn)的基因改變包括以PCR檢測為基礎的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）。由于LOH只在腫瘤患者中出現(xiàn)，健康人體內不存在，因此其檢測對腫瘤的診斷具有重要的臨床意義。針對血清或血漿的游離DNA的LOH檢測方法均有報道，但結果之間存在很大的差異。這種差異一部分來自于游離DNA與腫瘤組織間的差異，主要是游離DNA中LOH發(fā)生率較低，另一部分則是方法本身的原因，包括技術原因和背景DNA（由正常細胞釋放的DNA）對腫瘤DNA的稀釋作用。此外，在炎癥或組織修復過程中，良性細胞的異常增殖導致細胞凋亡增加，血液中小片段的DNA增加，也影響LOH的檢測［10］。

Schwarzenbach等［11］報道在388例乳腺癌患者的術前血漿標本中，檢測了8個微衛(wèi)星位點，其中對短片段游離DNA的LOH檢出率為38%，而長片段檢出率為28%，二者與腫瘤組織的一致性均為32.85%。這些LOH改變與腫瘤分期、大小、淋巴結轉移、孕激素受體陽性及HER2受體具有相關性。此外，攜帶有D12S1725位點（與細胞周期蛋白D2相關）LOH的患者總生存期較不攜帶患者更短。同樣，Shaw等［12］也報道，盡管LOH在血漿與配對組織中的檢出率在不同患者差異很大，但LOH與患者淋巴結轉移及生存期間存在顯著相關。

目前LOH檢測存在的主要問題是檢出率較低，且與組織標本的符合率差異性較大。從技術上對其進行改進有利于其在腫瘤診斷中的應用。此外，多個LOH位點進行聯(lián)合檢測也可提高腫瘤檢出率及檢測效率。

3.3表觀遺傳學改變表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的前提下，通過某些機制引起可遺傳的基因表達或細胞表現(xiàn)型的變化。表觀遺傳學的改變在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的作用。通過評估游離DNA甲基化的水平來預測腫瘤的患病風險已成為一個重要的研究內容。

為了提高分析的效能，從眾多已知的甲基化的基因中篩選出腫瘤相關基因至關重要。此外，表觀遺傳學改變與腫瘤并不是一一對應的，有些特定的腫瘤抑制基因，經(jīng)常在某些腫瘤中甲基化并且表達下調。Chimonidou等［13］用甲基化特異性PCR法檢測了123例乳腺癌患者CST6基因啟動子甲基化情況，結果顯示49例（39.8%）乳腺癌患者游離DNA高甲基化，而健康個體均低甲基化。隨后，該團隊還檢測了SOX17基因啟動子在原發(fā)性乳腺癌患者中的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)55例早期乳腺癌患者中有19例高甲基化，59例轉移性乳腺癌患者中有24例高甲基化，23例健康人中有1例甲基化［14］。同時，他們還檢測了循環(huán)腫瘤細胞中甲基化的情況，結果表明循環(huán)腫瘤細胞甲基化的情況與游離DNA之間存在相關性，從而也間接證明了游離DNA的來源。

3.4游離DNA完整性檢測近年來，游離DNA的完整性檢測逐漸成為研究的熱點。研究最多的是ALU和LINE1序列，他們最初被稱為“junk DNA”。近來的研究［15］表明，他們在DNA修復、轉錄、表觀遺傳學和轉座子等生理過程中可能起到了重要的作用。完整性檢測主要是基于腫瘤壞死過程所釋放的DNA片段一般較長，也就是DNA完整性較好，片段主要是200～400 bp大小之間，而正常人群游離DNA以凋亡為主，其DNA完整性較差。另一方面，由于ALU和LINE1序列分布在基因組的所有染色體上，因此在檢測時具有較高的靈敏度，但同時也相應地降低了對腫瘤檢測的特異性。研究［16］表明，采用PCR技術檢測血漿游離DNA的完整性可作為預測早期乳腺癌的發(fā)展及微轉移（直徑≤1 mm的微小轉移灶，通常須經(jīng)病理組織學檢查方能診斷）的一項重要指標。此外，游離DNA的完整性分析也被用于膀胱癌、大腸癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌等腫瘤的診斷中。

目前，對于游離DNA完整性的研究仍然較少，其是否可以作為多種腫瘤診斷的一個通用的生物學標志物在臨床應用仍有待進一步深入研究。

3.5病毒DNA檢測有些腫瘤中可發(fā)現(xiàn)病毒的游離DNA。例如，EB病毒（epstein-barr virus，EBV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV），分別是鼻咽癌、肝癌、子宮頸癌的發(fā)病原因之一。

這些特定的病毒DNA可以用來作為腫瘤診斷的分子標志物。已報道的游離DNA與腫瘤間存在相關性的有：EBV與霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌相關；HBV與某些類型的肝細胞癌相關；HPV與子宮頸癌相關等。多個大樣本的研究［17，18］已證明，EBV游離DNA在鼻咽癌的診斷和預后判斷中具有重要的臨床價值。檢測EBV的游離DNA作為評估鼻咽癌惡性程度的一項指標已在鼻咽癌的高發(fā)區(qū)—中國大陸、香港和臺灣地區(qū)廣泛開展。病毒游離DNA檢測的一個主要局限性是良性的病毒感染患者游離病毒DNA水平也可升高，這對于臨床的診斷篩查具有一定的干擾。因此建立具有臨床診斷意義的cut-off值是很有必要的。

4　展望

檢測技術的改進使得我們可以對游離DNA進行分析。通過分析腫瘤患者和健康個體游離DNA的差異，為非侵入性腫瘤診斷方法提供了一種新的可能性。同時，我們應該認識到，目前大量的病例對照研究顯示結果存在較大差異，因此將這一技術成功應用于臨床仍需做更大量的研究及驗證。特別是對于程序的標準化及標準的控制需要作出努力，從而為實驗室成果轉化為臨床應用做好準備。

1Mandel P，M＇etais P.Les acides nucleiques du plasma sanguin chezl homme.Acad Sci Paris，1948，142：241-243.

2Vasioukhin V，Anker P，Maurice P，et al.Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia.Br J Haematol，1994，86：774-779.

3Sorenson GD，Pribish DM，Valone FH，et al.Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1994，3：67-71.

4Nawroz H，Koch W，Anker P，et al.Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients.Nat Med，1996，2：1035-1037.

5Fan HC，Blumenfeld YJ，Chitkara U，et al.Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing.Clin Chem，2010，56：1279-1286.

6Bendich a，Wilczok t，Borenfreund e.Circulating dna as a possible factor in oncogenesis.Science，1965，148：374-376.

7Sozzi G，Roz L，Conte D，et al.Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.J Natl Cancer Inst，2005，97：1848-1850.

8Shapiro B，Chakrabarty M，Cohn EM，et al.Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease.Cancer，1983，51：2116-2120.

9Cancer Genome Atlas Network.Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.Nature，2012，490：61-70.

10Schwarzenbach H，Pantel K，Kemper B，et al.Comparative evaluation of cell-free tumor DNA in blood and disseminated tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer.Breast Cancer Res，2009，11：R71.

11Schwarzenbach H，Eichelser C，Kropidlowski J，et al.Loss of heterozygosity at tumor suppressor genes detectable on fractionated circulating cell-free tumor DNA as indicator of breast cancer progression. Clin Cancer Res，2012，18：5719-5730.

12Shaw JA，Page K，Blighe K，et al.Genomic analysis of circulating cell-free DNA infers breast cancer dormancy.Genome Res，2012，22：220-231.

13Chimonidou M，Tzitzira A，Strati A，et al.CST6 promoter methylation in circulating cell-free DNA of breast cancer patients.Clin Biochem，2013，46：235-240.

14Chimonidou M，Strati A，Malamos N，et al.SOX17 promoter methylation in circulating tumor cells and matched cell-free DNA isolated from plasma of patients with breast cancer.Clin Chem，2013，59：270-279.

15Oler AJ，Traina-Dorge S，Derbes RS，et al.Alu expression in human cell lines and their retrotranspositional potential.Mobile DNA，2012，3：11.

16Lehner J，Stotzer OJ，F(xiàn)ersching DM，et al.Plasma DNA integrity indicates response to neoadjuvant chemotherapy in patients with locally confined breast cancer.Int J Clin Pharmacol Ther，2013，51：59-62.

17Chan KC，Hung EC，Woo JK，et al.Early detection of nasopharyngeal carcinoma by plasma Epstein-Barr virus DNA analysis in a surveillance program.Cancer，2013，119：1838-1844.

18Wang WY，Twu CW，Chen HH，et al.Long-

term survival analysis of nasopharyngeal carcinoma by plasma Ep-

stein-Barr virus DNA levels.Cancer，2013，119：963-970.

（本文編輯：李霦）

周新，E-mail：zhouxjyk@163.com

（2015-04-21）