病理石蠟標本基因檢測中D N A提取(離心柱型)的幾點體會

陳順平，蘇海燕，吳文喬

(福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院病理科，福建 漳州363000)

隨著分子生物技術(shù)在臨床中開展，其所覆蓋的檢測疾病的范圍越來越廣，不僅在常規(guī)醫(yī)學檢驗中，近年來隨著臨床靶向治療的普及，病理腫瘤標本的相關(guān)基因檢測也得到發(fā)展。然而，什么樣的病理標本適合做基因檢測？怎么才能夠得到更多更好的DNA呢？是目前我們病理科開展此項目所面對的問題。經(jīng)過我們不斷實踐，現(xiàn)將幾點體會介紹如下。

1 標本及時合適的固定是石蠟標本基因檢測的關(guān)鍵步驟

活組織或脫落細胞應(yīng)得到及時且合適固定液固定，一般活組織離體30 min內(nèi)凍存或10%中性緩沖福爾馬林固定，脫落細胞應(yīng)及時離心，-80℃保存或用棉絮紙包裹，按組織常規(guī)處理。合適固定液及時固定可以大大降低DNA的降解，減少基因的片段化，同時避免使用含重金屬固定液，如Bouin液等。若標本固定不佳，在后期的標本制備過程則無法加于糾正。臨床送檢組織標本時間與固定后標本取材時間之差最好統(tǒng)一，一般為6～48 h為好[1,2]?；顧z小標本一般為6～12h，組織大標本為6～48h且按要求剖開固定，保證標本充分固定，有效保護細胞中DNA質(zhì)量，提高DNA提取效率，保證檢測結(jié)果的可靠性。

2 足夠的腫瘤細胞是石蠟標本基因檢測的必備要求

足夠的腫瘤細胞是基因檢測DNA提取的基本條件，也是必備要求。在挑取腫瘤組織蠟塊時，應(yīng)充分地考慮腫瘤細胞數(shù)量、組織類型及避開壞死組織等。在提取標本DNA時一般應(yīng)首先進行病理評估，了解腫瘤細胞的數(shù)量、腫瘤細胞百分比及組織類型，如達不到病理評估的要求則應(yīng)終止下游基因檢測，符合要求進行下游檢測。實際過程中我們可在切取病理石蠟標本做DNA提取時切一張白片用于HE染色于判斷腫瘤百分比及腫瘤細胞數(shù)。如該標本已行免疫組化檢測時不能將用于常規(guī)病理診斷的HE染色制片中腫瘤細胞分布情況用于病理評估，在切取標本提取DNA時再切一張白片用于染色，以免免疫組化檢測后腫瘤細胞數(shù)量不足，特別是活檢小標本。腫瘤細胞含量的最小比例應(yīng)由不同檢測方法的敏感度決定，專家共識認為要求腫瘤細胞數(shù)一般要求大于200個，且腫瘤細胞應(yīng)占整張切片所有細胞10%以上[2]。實際操作中應(yīng)盡量刮取腫瘤細胞豐富的區(qū)域且避開壞死或紅細胞較多的區(qū)域用于DNA的提取，可以提取到高質(zhì)量相關(guān)DNA，特別是測序技術(shù)，同時可降低PCR擴增抑制物的存在。手術(shù)根治標本是我們病理基因檢測的最好標本，腫瘤細胞較多、含量比例高。相反，活檢小標本一般腫瘤細胞數(shù)偏少。如腫瘤細胞數(shù)量不夠，可多切組織切片彌補腫瘤細胞不足，但應(yīng)保證腫瘤細胞占整張切片所有細胞10%以上，如腫瘤細胞所占比例小于10%，組織標本應(yīng)脫蠟后切除無關(guān)細胞已達到要求，這樣腫瘤細胞提取相關(guān)DNA質(zhì)量仍好。同時應(yīng)對病理評估結(jié)果做好記錄，方便與DNA提取結(jié)果進行比較，累積經(jīng)驗。

3 D N A提取是石蠟標本基因檢測的前提條件

3.1 標本的選擇 一般選擇病理組織蠟塊保存時間越短越好。組織標本經(jīng)過福爾馬林固定，可引起組織蛋白與核酸交聯(lián)反應(yīng)。石蠟組織標本保存時間越長，核酸片段化越嚴重，加劇核酸甲基化修飾，核酸提取質(zhì)量越差，濃度偏低[3]。保存時間長的標本切片時應(yīng)盡量切掉與空氣接觸的外層組織再切取組織進行DNA提取，特別是未行封蠟的組織蠟塊。

3.2 標本的處理 石蠟標本在進行切片前，應(yīng)將切片機清潔干凈，可用75%乙醇消毒臺面及鑷子等。每個標本應(yīng)選擇一個刀口，嚴格控制標本間交叉污染。手術(shù)根治標本最好選擇5μm～10μm切片黏附載玻片上，脫蠟完后用手術(shù)刀轉(zhuǎn)移組織，簡便、省時；而活檢小標本可以選擇EP管收集連續(xù)切片，管內(nèi)脫蠟，達到盡可能收集腫瘤細胞。在進行組織切片時不建議厚度超過10μm或低于5μm，過厚組織切片會增加脫蠟的困難，也增加細胞酶消化和裂解的難度；過薄則容易產(chǎn)生DNA斷裂。如選擇EP管二甲苯脫蠟時乙醇去除二甲苯后，應(yīng)晾干方可進入下一步驟，殘存有機溶劑會降低提取率及后續(xù)擴增效率。對于EP管脫蠟，應(yīng)關(guān)注EP管底至少有肉眼可見的樣本存在，以保證足夠DNA用于下游檢測。

3.3 DNA的提取 DNA提取一般情況下應(yīng)嚴格按照本實驗室的SOP文件執(zhí)行，然而在實際操作過程中往往要對不同情況進行針對性處理，才能獲得比較滿意的結(jié)果，筆者歸納如下。

3.1 酶及裂解 實驗中標本消化一般用蛋白酶K，其濃縮粉末可室溫15~30℃保存，分裝完應(yīng)放入-20℃保存。DNA提取操作中首先溫度設(shè)定為56℃蛋白酶K的消化及裂解過程，最佳工作消化時間視標本而定，不同的標本一般不一樣[4]。過量的標本含量將影響酶的消化及裂解效果，標本含量越多消化及裂解時間應(yīng)越長，酶消化完成后應(yīng)檢查酶消化效果，如還有很明顯的組織漂浮物應(yīng)說明樣本加入量偏大應(yīng)適度延長酶消化時間。適量加大酶量或延長消化時間有助于加強消化裂解作用[5,6]。蛋白酶K消化一定要滿足DNA釋放完全有效，保證以滿足后續(xù)實驗需要DNA的量[7]。蛋白酶K消化裂解后進入90℃滅活，此階段裂解液對修飾DNA及釋放DNA進一步發(fā)揮作用。

3.2 DNA洗滌 DNA洗滌液使用前按要求加入無水乙醇，使其成為合格的DNA洗滌液，否則造成DNA柱上流失，大大降低其濃度。DNA洗滌時將洗滌液靜置時間應(yīng)嚴格控制，保證洗滌液與核酸有充分的反應(yīng)時間，提高標本DNA洗滌效果。

3.3 DNA洗脫 洗脫液pH不合適，將會減少DNA提取效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0～8.5之間。為了提高DNA洗脫效率，可在加入洗脫液后在室溫靜置至少3min以上，腫瘤細胞偏少應(yīng)5min以上，再按要求離心。加入洗脫液量可根據(jù)我們病理評估及基因檢測要求量的結(jié)果適度加減，超過200μl洗脫體積所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少。建議活檢小標本DNA洗脫液體積應(yīng)小于 100μl。

4 D N A定量

提取的DNA應(yīng)經(jīng)過定量以保證足夠適量的DNA含量用于下游突變檢測。DNA提取后應(yīng)立即進行DNA濃度測定，隨后存儲DNA樣本?？衫梅止夤舛扔嬙?60nm處光密度值和銀光染料法DNA總量檢測，OD260nm/OD280nm比值可直觀判斷基因的純度，一般值為1.8～2.0較好，該方法較簡便，但無法評估可擴增的DNA片段和PCR抑制物。若DNA含量的確不符合檢測要求應(yīng)終止進一步檢測，以節(jié)約成本和時間。

綜上所述，在病理石蠟標本基因檢測DNA提取中，我們應(yīng)盡量了解每個步驟的作用以及學會如何控制石蠟標本DNA提取的關(guān)鍵點，這是對石蠟標本基因檢測的操作者必備要求，也是如何防止假陽性假陰性結(jié)果的出現(xiàn)而采取了質(zhì)量保證措施，同時也是我們病理科開展基因檢測項目前提[8]。

[1]中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家組.中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識[J].中華病理學雜志,2011,40(10):700-702.

[2]衛(wèi)生部病理質(zhì)控與評價中心,結(jié)直腸癌KRAS基因突變檢測專家組.中國結(jié)直腸癌KRAS基因突變檢測專家共識[J].中華病理學雜志,2012,41(9):635-636.

[3]李丹,劉亞麗,劉靜,等.石蠟組織存放時間對提取DNA質(zhì)量的影響[J].河南大學學報(醫(yī)學版),2014,33(1):9-13.

[4]陳順平.FISH中酶消化細胞的幾點體會[J].臨床與實驗病理學雜志,2010,26(1):116-117.

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[7]張玲玲,劉月平,王永軍,等.石蠟包埋組織基因組DNA提取的條件優(yōu)化[J].臨床與實驗病理學雜志,2011,27(9)：1021-1023.

[8]李金明.實時熒光PCR技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2009:383.