克服單倍體相合造血干細(xì)胞移植免疫屏障的策略

何祎，韓明哲（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所移植中心，天津 300020）

異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是惡性血液病的有效治療手段，供者來源困難一直限制了此項技術(shù)的廣泛應(yīng)用。單倍體相合造血干細(xì)胞移植（haplo-HSCT）使3/6相合親屬移植成為可能，其中3/6相合親屬可來源于父母、同胞、堂兄妹、表親之一，幾乎能為100%的人群找到供者，有望從根本上解決供者來源問題。haplo-HSCT還具有易于取得干細(xì)胞以及今后有可能再次采集供者干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療等優(yōu)點，從而引起人們的廣泛關(guān)注。同時由于供受者人類白細(xì)胞抗原（HLA）差異性增大，使得克服HLA免疫屏障的難度增加。本文就近年人們在克服haplo-HSCT免疫屏障方面采取的策略做一綜述。

1 體外T細(xì)胞去除（TCD）的單倍體造血干細(xì)胞移植

1.1 體外廣泛TCD：Perugia等［1］采用免疫磁珠分選CD34+細(xì)胞的方法進(jìn)行移植物體外TCD。他們獲得的移植物含有大劑量CD34+細(xì)胞（平均≥10×106/kg受者體重），并且CD3+細(xì)胞數(shù)量減少3～4個對數(shù)級。這一移植模式可以確保高植入率，盡管移植后不進(jìn)行移植物抗宿主病（GVHD）的預(yù)防，GVHD的發(fā)生率也很低，但由于有助于移植后免疫重建的自然殺傷（NK）細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞（DCs）等也同時被去除，這種模式在移植后免疫重建緩慢，機會性感染（如病毒和真菌感染）的發(fā)生率增加，非復(fù)發(fā)病死率較高。Perugia小組［2］在現(xiàn)有模式的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了移植后過繼回輸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）對免疫重建的影響，并首次證實了通過過繼回輸Tregs能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞重建，并改進(jìn)對機會性病原菌的免疫重建，而不減弱移植物抗白血?。℅VL）效應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)提示，為改善臨床預(yù)后進(jìn)行過繼性輸注基因修飾的T細(xì)胞和/或病原體特異性T細(xì)胞的必要性。

1.2 體外選擇性TCD

1.2.1 選擇性去除CD3+/CD19+細(xì)胞：上文提到廣泛TCD模式移植后免疫重建延遲，有研究者提出采用移植物陰性選擇去除CD3+/CD19+細(xì)胞，可以保留NK細(xì)胞、單核細(xì)胞以及DCs等。與未經(jīng)處理的采集物移植相比，引起GVHD和B細(xì)胞淋巴增殖性疾病的發(fā)生率較低。最近一項研究顯示，61例成人高危惡性血液病患者接受了減低劑量預(yù)處理和移植物去除CD3+/CD19+細(xì)胞的haplo-HSCT。55/61的患者獲得植入，中性粒細(xì)胞數(shù)量大于0.5×109/L和血小板數(shù)量大于20×109/L的中位時間分別為12天和11天。Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD的發(fā)生率分別為46%和18%。100天和2年的非復(fù)發(fā)病死率（NRM）分別為23%和42%。2年復(fù)發(fā)率為 31%，總生存率（OS）為 28%［3］。

1.2.2 選擇性去除T細(xì)胞抗原受體（TCR）α、β+/CD19+細(xì)胞：γδT細(xì)胞是一群不引起GVHD但可能具有抗白血病作用的細(xì)胞［4］。有研究顯示，41例進(jìn)展期血液病患兒接受了haplo-HSCT，移植物通過使用CliniMACS （美天旎）的免疫磁珠分選系統(tǒng)去除了TCRα、β+/CD19+細(xì)胞。植入率為88%，Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD發(fā)生率分別為10%和15%。CD3+細(xì)胞＞ 100/μl、CD19+細(xì)胞＞ 200/μl以及CD56+細(xì)胞＞200/μl的中位時間分別為13、127和12.5天，顯示免疫重建迅速［5］。

1.3 體外阻斷共刺激途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞無能：T細(xì)胞活化的雙信號模型顯示T細(xì)胞必須接觸抗原（第一信號）和共刺激信號（第二信號）才能有效活化，當(dāng)僅有抗原刺激而缺乏共刺激信號時，將導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞耐受［6］。研究最多的共刺激分子對是T細(xì)胞上CD28受體和抗原呈遞細(xì)胞（APCs）上的B7-1（CD80）或B7-2（CD86）配體。細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4（CTLA-4Ig）是一種重組融合蛋白，通過高親和力結(jié)合B7分子，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受或無能，并防止B7分子和CD28的結(jié)合，有效阻斷第二信號的傳導(dǎo)。Guinan等［7］治療了11例haplo-HSCT患者，在加入CTLA-4Ig的條件下，將供者骨髓（BM）與照射后的受者細(xì)胞共孵育，使得受者反應(yīng)性輔助T細(xì)胞數(shù)量減少1～4個對數(shù)級，而不影響輔助T細(xì)胞對第三者異基因抗原刺激的反應(yīng)性。臨床結(jié)果顯示，所有11例患者均獲得植入，僅3例患者發(fā)生GVHD。

然而，上述所有體外TCD方法均治療費用昂貴，細(xì)胞處理過程繁瑣，需要有較高專業(yè)知識的人員指導(dǎo)參與，并非絕大多數(shù)移植中心均可廣泛實施。

2 T細(xì)胞充足（TCP）的單倍體造血干細(xì)胞移植

2.1 移植后高劑量環(huán)磷酰胺（PT/Cy）：當(dāng)在移植后狹窄的窗口期給予高劑量環(huán)磷酰胺（Cy），即移植后高劑量環(huán)磷酰胺（PT/Cy），能去除供者和宿主同種反應(yīng)性T細(xì)胞，抑制GVHD以及移植物排斥。作為藥物誘導(dǎo)免疫耐受的一種，PT/Cy策略利用的特性是增殖期同種反應(yīng)性T細(xì)胞比靜息期非同種反應(yīng)性T細(xì)胞對DNA損傷劑的細(xì)胞毒性作用更為敏感。210例惡性血液病患者在約翰霍普金斯大學(xué)接受了減低強度預(yù)處理和半倍體骨髓移植（BMT）及高劑量PT/Cy，累積Ⅱ～Ⅳ度、Ⅲ～Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD的發(fā)生率分別為27%、 5%和13%，2年累積復(fù)發(fā)率和NRM分別為51%和15%，2年無事件生存（EFS）為34%；79例患者死于惡性病復(fù)發(fā)，相反，僅15例患者死于機會性感染，5 例死于 GVHD［8］。

Ciurea等［9］比較了 TCP聯(lián)合 PT/Cy和 TCD兩種移植模式進(jìn)行haplo-HSCT的療效，共65例患者入組，兩組患者均接受相同的預(yù)處理即氟達(dá)拉濱〔40 mg /（m2·d）×4〕、馬法蘭（140 mg/m2）以及噻替派（10 mg/kg）。在TCP組和TCD組中植入率分別為94%和81%（P=0.1）。一年NRM在TCP組和TCD組分別為16%和42%（P=0.03）。在TCP組和TCD組，累積的Ⅱ～Ⅳ度aGVHD和cGVHD分別為27%對11%（P=0.5）和8%對18%（P=0.03）。在TCP組和TCD組，一年OS和無進(jìn)展生存期 （PFS） 分別為66%對30% （P=0.02）和45%對21%（P=0.03）。TCP組改善的NRM和移植后良好的T細(xì)胞免疫重建相關(guān)。另一項研究顯示，采用TCP聯(lián)合PT/Cy模式的單倍體移植后免疫重建優(yōu)于成人相合無關(guān)供者（MUD）或臍帶血移植，甚至達(dá)到同胞全合供者（MSD）移植水平。針對人類巨細(xì)胞病毒（CMV）特異性T細(xì)胞的迅速恢復(fù)可以解釋低的感染相關(guān)死亡，提示PT/Cy 模式保留了和重建感染免疫相關(guān)的靜息期記憶T 細(xì)胞［10］。

Bashey等［11］比較了 PT/Cy模式 haplo-HSCT（減低強度27例、清髓18例）和同期進(jìn)行的HLA相合親緣供者（MRDs，n=115）及MUDs（n=99）移植的療效。生存患者中位隨訪時間為36個月（范圍9～74.5月）。36個月的OS在3種類型移植患者中沒有顯著性差異（在MRD、MUD和haplo-SCT分別為71%、58%和58%，P值無顯著性差異）。36個月無病生存率（DFS）分別為47%、46%和55%，3組亦無顯著差異。36個月預(yù)計的累積復(fù)發(fā)率在MRD、MUD和haplo-HSCT組分別為35%、38%和36%，差異亦無顯著性。這些結(jié)果提示，haplo-SCT的療效可以與MRD或MUD SCT相比。對于缺乏HLA相合供者的患者，部分不合同胞供者（PMRDs） 是一個可供選擇的供者來源。

同時，我們也應(yīng)注意到，PT/Cy模式盡管植入率高，GVHD以及NRM發(fā)生率低，但移植后復(fù)發(fā)率高仍是今后需要著重解決的難題。相信隨著預(yù)處理方案的改進(jìn)、移植后微小殘留病的監(jiān)測以及過繼免疫治療的開展，該模式的臨床療效會進(jìn)一步提高。

2.2 供受者同時誘導(dǎo)免疫耐受的單倍體造血干細(xì)胞移植：國內(nèi)黃等［12-15］采用供受者同時誘導(dǎo)免疫耐受的haplo-HSCT，即不進(jìn)行體外移植物處理，通過粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）體內(nèi)誘導(dǎo)供者免疫耐受，強免疫抑制（主要是ATG）誘導(dǎo)受者免疫耐受等措施，可有效控制HLA不合所致的同種反應(yīng)性。G-CSF體內(nèi)應(yīng)用后可使骨髓及外周血移植物內(nèi)免疫細(xì)胞的構(gòu)成發(fā)生改變，移植物內(nèi)T細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞因子分泌Th1極化為Th2，故有利于免疫耐受的形成。ATG的作用機制如下［16-18］：① ATG在血液和外周淋巴組織通過補體依賴溶解、T細(xì)胞激活和凋亡發(fā)揮體內(nèi)TCD作用；② ATG調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞表面分子，包括整合素 a4b7、VLA-4、CXCR4、CCR5和 CCR7，從而導(dǎo)致白細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞相互作用；③ ATG誘導(dǎo)B細(xì)胞系和骨髓瘤細(xì)胞系的凋亡；④ ATG抑制髓系來源不成熟DCs的成熟，髓系來源不成熟DCs具有和耐受性DCs一致的表型；⑤ ATG誘導(dǎo)Treg和NK T細(xì)胞。Feng等［19］發(fā)現(xiàn)僅兔的ATG能夠促進(jìn)功能性Tregs體外擴增。逆轉(zhuǎn)CD4+CD25-T細(xì)胞為Tregs，可以通過增強活化的T細(xì)胞核因子表達(dá)或誘導(dǎo)耐受性 DCs［20］。黃等［21］共報道 756例患者，3年預(yù)計的OS和無白血病生存率（LFS）分別為67%和63%。采用該方式因移植物中存在大量的T細(xì)胞可以促進(jìn)免疫重建并預(yù)防復(fù)發(fā)，但同時急慢性GVHD發(fā)生率亦高于TCD模式，提示進(jìn)一步改進(jìn)GVHD預(yù)防的必要性。

總之，盡管近幾年人們在克服haplo-HSCT免疫屏障方面取得了長足進(jìn)步，嘗試了多種克服單倍體移植HLA屏障的模式，但往往各有優(yōu)缺點，到目前為止還沒有一個公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)模式。創(chuàng)新的模式應(yīng)向降低GVHD和植入失?。℅R）發(fā)生率、迅速的免疫重建、增強抗白血病和抗病原體免疫反應(yīng)以及改善移植預(yù)后等方向發(fā)展。