核黃素對(duì)鹽脅迫下杜梨葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

韓金龍， 李 慧， 藺 經(jīng)， 楊青松， 常有宏

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)

院，江蘇 南京210095)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)作物生產(chǎn)的主要因素之一［1］。目前中國鹽漬化土地面積不斷擴(kuò)大，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鹽脅迫下，植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)Na+過量積累，導(dǎo)致滲透脅迫、離子毒害、離子不平衡或營養(yǎng)缺乏［2］，傷害細(xì)胞中的抗氧化系統(tǒng)，影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。為更好地利用鹽漬地資源，緩解土壤鹽漬化問題，通過施加外源緩解劑以提高植物抗鹽性已越來越受到人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)施用外源赤霉素( GA3)［3］、油菜素內(nèi)酯( EBR)［4］、5-氨 基 酮 戊 酸( ALA)［5］、水 楊 酸( SA)［6］、氯化鈣［3］等均能提高植物的耐鹽性，這一調(diào)控過程通常與植株葉片中抗氧化酶活性上升有關(guān)。

核黃素( Riboflavin，Rib) 又稱維生素B2( Vitamin B2) ，是一種天然水溶性的B 族維生素。核黃素及其衍生物FMN 和FAD 是植物光合作用、能量生成和氧化還原代謝不可或缺的組成部分［7］。應(yīng)用核黃素可以增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性、提高耐旱及抗?jié)衬芰?，這可能與其促進(jìn)生理代謝過程，誘發(fā)細(xì)胞中抗氧化物質(zhì)的合成有關(guān)。在逆境條件下，植物體內(nèi)存在重新分配核黃素的機(jī)制來調(diào)控環(huán)境脅迫反應(yīng)［8-13］。然而，目前尚無應(yīng)用核黃素提高植物耐鹽能力的報(bào)道。

梨是中國重要的果樹，土壤鹽漬化程度及面積的進(jìn)一步擴(kuò)展嚴(yán)重限制其生產(chǎn)［14-16］。嫁接為梨樹的主要繁殖方式，砧木的抗性對(duì)嫁接苗的適應(yīng)能力至關(guān)重要。提高砧木的耐鹽性是解決梨樹耐鹽堿的關(guān)鍵，杜梨( Pyrus betulaefolia Bunge) 原產(chǎn)中國，以其為嫁接砧木，能夠改善梨樹的耐鹽性［17-18］。在鹽脅迫條件下，該物種通過減少Na+在根中積累及向地上部運(yùn)輸來適應(yīng)逆境［18-20］，但植株葉片仍會(huì)受到氧化傷害［21］。本試驗(yàn)通過研究不同濃度的核黃素對(duì)鹽脅迫下杜梨葉片活性氧產(chǎn)生、抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的影響，探討通過施加核黃素緩解鹽脅迫產(chǎn)生氧化傷害的可能性，旨在為核黃素應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)和處理

杜梨種子經(jīng)1%次氯酸鈉消毒后，播種于培養(yǎng)皿濕潤(rùn)無菌濾紙上。待胚根長(zhǎng)至1 cm 時(shí)，將幼苗移植到光照培養(yǎng)箱的水培系統(tǒng)中( 培養(yǎng)液為Hoagland營養(yǎng)液，pH=5.8) ，用通氣泵補(bǔ)充空氣，每3 d 更換1 次培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件如下: 光照周期16 h 光照/8 h 黑暗，光照度300 μmol/( m2·s) ，培養(yǎng)溫度23 ～25 ℃，空氣相對(duì)濕度60% ～70 %。當(dāng)植株8 葉1心大小時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯幼苗進(jìn)行處理，在含200 mmol/L NaCl 的Hoagland 營養(yǎng)液中添加100 mmol/L的核黃素母液，使其在水培系統(tǒng)中的濃度達(dá)到0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 和100 μmol/L。以生長(zhǎng)在不含NaCl 和核黃素的Hoagland 營養(yǎng)液中的植株為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)，處理3 d 后收集植株頂部下第3、4 葉用于各生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 活性氧和丙二醛含量 過氧化氫( H2O2) 含量測(cè)定參照Patterson 等［22］的方法，新鮮葉片用2 ml預(yù)冷丙酮提取后，經(jīng)5 %硫酸鈦處理所生成的氧化物-鈦復(fù)合物黃色沉淀，再用2 mol/L H2SO4溶解，在415 nm 波長(zhǎng)下比色測(cè)定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葉片中H2O2含量。采用羥胺氧化法測(cè)定超氧陰離子產(chǎn)生速率［23］。采用硫代巴比妥酸( TBA) 法測(cè)定丙二醛( MDA) 含量［24］。

1.2.2 抗氧化酶活性 蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［25］;超氧化物歧化酶( SOD) 活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(Nitroblue tretrazolium chloride，NBT)光氧化還原法，以抑制NBT 光氧化還原50% 的酶量為1 個(gè)酶活性單位［26］;過氧化物酶( POD) 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［26］，以1 min 內(nèi)OD470值變化0.01 為1 個(gè)酶活性單位;過氧化氫酶(CAT) 活性測(cè)定參照文獻(xiàn)［27］的方法，以1 min 內(nèi)OD240值變化0.1 為1 個(gè)酶活性單位;谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)法，以340 nm 處吸光值變化計(jì)算GR 活性［28］;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測(cè)定參考黃愛纓等［29］的方法，以1 mg 蛋白質(zhì)1 min 使反應(yīng)體系中GSH 濃度降低1 μmol/L為1 個(gè)活性單位;抗壞血酸過氧化物酶( APX)活性測(cè)定參照Nakano 等［30］的方法測(cè)定，以1 min 內(nèi)OD290值變化0.1 為1 個(gè)酶活性單位。

1.2.3 抗氧化物質(zhì)含量 總谷胱甘肽( Glutathione，GSH) 含量測(cè)定采用5，5-二巰基-2-硝基苯酸(5，5-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB) 法［31］; 抗壞血酸( Ascorbic acid，AsA) 含量測(cè)定采用分光光度法，在紅菲咯啉存在的條件下，AsA 所還原的亞鐵離子與其反應(yīng)形成紅色螯合物，通過測(cè)定OD534值計(jì)算AsA 含量［32］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2007 整理數(shù)據(jù)和繪制圖表。用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析( One-way ANOVA) ，并用最小顯著差數(shù)法( LSD 法) 進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 核黃素對(duì)鹽脅迫下杜梨葉片活性氧和MDA含量的影響

MDA 是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低是反映細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo)［33］，而和H2O2是誘發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化的重要因子。在鹽脅迫(200 μmol/L NaCl)處理3 d 后，杜梨葉片中超氧陰離子的產(chǎn)生速率是對(duì)照的2.13 倍，H2O2和MDA 含量分別是對(duì)照的2.24 和1.64 倍( 表1) ，意味著植株葉片細(xì)胞活性氧代謝系統(tǒng)失去平衡，發(fā)生膜脂過氧化。施加5 ～100 μmol/L核黃素( Rib) 后，的產(chǎn)生速率、H2O2和MDA 含量隨著Rib 濃度的增加呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)。當(dāng)Rib 濃度為5 ～10 μmol/L時(shí)，的產(chǎn)生速率和H2O2含量較鹽脅迫處理顯著降低( 分別降低了44.3% ～55.2%和44.6% ～51.4%) ，MDA 含量亦顯著降低( 降低了9.5% ～24.0%) ，且10 μmol/L Rib處理組中，上述3 個(gè)指標(biāo)最低( 表1) 。然而，當(dāng)Rib濃度為50 ～100 μmol/L時(shí)，反而會(huì)刺激活性氧的積累(O2·－產(chǎn)生速率和H2O2含量增加) ，加劇膜質(zhì)過氧化( MDA 積累) ( 表1) 。

2.2 核黃素對(duì)鹽脅迫下杜梨葉片抗氧化酶活性的影響

由表2 可知，鹽脅迫( 200 μmol/L NaCl) 處理3 d 后，杜梨葉片中超氧化物歧化酶( SOD) 活性顯著降低( 僅為對(duì)照的60.4 %) ，過氧化物酶( POD) 、過氧化氫酶( CAT) 、谷胱甘肽還原酶( GR) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px) 、抗壞血酸過氧化物酶( APX)活性均有不同程度升高( 為對(duì)照的1.18 ～1.78倍) 。這表明NaCl 脅迫可輕微誘導(dǎo)杜梨葉片中POD、CAT、GR、GSH-Px 和APX 活性提高，抑制SOD的活性。施加5 ～100 μmol/LRib 后，抗氧化酶活性均隨著Rib 濃度的增加呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。當(dāng)Rib 濃度為10 μmol/L時(shí)，抗氧化酶活性與單獨(dú)鹽脅迫處理間的差異最顯著( 為鹽脅迫下的1.46 ～1.95 倍) ( 表2) 。然而，當(dāng)Rib 濃度為50 ～100 μmol/L時(shí)，抗氧化酶活性較10 μmol/L Rib 處理又顯著降低，且100 μmol/L Rib 處理與單獨(dú)鹽脅迫處理相比較，抗氧化酶活性無顯著差異( 表2) 。

表1 核黃素(Rib) 對(duì)NaCl 脅迫下杜梨葉片產(chǎn)生速率、H2 O2和MDA 含量的影響Table 1 Effects of riboflavin( Rib) on production rate of ，contents of H2O2 and MDA in the leaves of Pyrus betulaefolia under NaCl stress

表1 核黃素(Rib) 對(duì)NaCl 脅迫下杜梨葉片產(chǎn)生速率、H2 O2和MDA 含量的影響Table 1 Effects of riboflavin( Rib) on production rate of ，contents of H2O2 and MDA in the leaves of Pyrus betulaefolia under NaCl stress

不同小寫字母代表不同處理間在0.05 水平上差異顯著。

處理NaCl(μmol/L)Rib(μmol/L)H2O2含量( nmol/g)O2·－產(chǎn)生速率［nmol/( g·min) ］丙二醛含量( nmol/g)0 0 70.04 ±5.68 c 2.39 ±0.23 d 16.73 ±1.13 cd 200 0 157.07 ±11.91b 5.67 ±0.69c 27.38 ±1.22ab 200 5 87.00 ±7.62c 3.16 ±0.28d 24.77 ±1.23bc 200 10 76.33 ±5.55c 2.54 ±0.19d 20.81 ±1.17c 200 50 196.33 ±16.64a 6.49 ±0.41a 30.39 ±1.61a 200 100 223.00 ±11.89a 7.78 ±0.31a 32.10 ±1.63a

表2 核黃素對(duì)NaCl 脅迫下杜梨葉片中抗氧化酶活性的影響Table 2 Effect of riboflavin on the activities of antioxidative enzymes in the leaves of P. betulaefolia under NaCl stress

2.3 核黃素對(duì)鹽脅迫下杜梨葉片抗氧化物質(zhì)含量的影響

鹽脅迫(200 μmol/L NaCl) 處理3 d 后，杜梨葉片中抗氧化物質(zhì)GSH 和AsA 的含量顯著降低( 僅為無鹽脅迫對(duì)照的38.2% ～44.9%) ( 表3) ，嚴(yán)重影響了植株自身清除自由基的能力。施加5 ～100 μmol/L核黃素后，抗氧化物質(zhì)含量隨著核黃素濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)( 表3) 。當(dāng)Rib 濃度為5 ～50 μmol/L時(shí)，GSH 和AsA 含量較單獨(dú)鹽脅迫處理顯著提高，其中以Rib 濃度為10 μmol/L時(shí)差異最顯著，含量分別為鹽脅迫下的3.76 和2.35 倍。而當(dāng)Rib 濃度為100 μmol/L時(shí)，抗氧化物質(zhì)含量反而降低，與鹽脅迫下的無顯著差異( 表3) 。

表3 核黃素對(duì)NaCl 脅迫下杜梨葉片中抗氧化物質(zhì)GSH 和AsA 含量的影響Table 3 Effect of riboflavin on antioxidants (GSH and AsA) contents in the leaves of P. betulaefolia under NaCl stress

3 討論

正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除保持一種動(dòng)態(tài)平衡，而在鹽脅迫下，植物體內(nèi)活性氧的積累是導(dǎo)致傷害的主要原因之一［34-35］，細(xì)胞內(nèi)活性氧的爆發(fā)，會(huì)打破其產(chǎn)生和清除之間的平衡，積累大量的丙二醛( MDA) ，造成膜脂過氧化［36］。對(duì)蘿卜和小麥的研究結(jié)果表明，鹽脅迫下產(chǎn)生速率、H2O2和MDA 含量急劇增加，而外源油菜素內(nèi)酯( EBR) 顯著降低了的產(chǎn)生速率，以及H2O2和MDA 含量［4，37］，明確EBR 能抑制植物細(xì)胞膜脂過氧化，起緩解鹽脅迫的作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，杜梨葉片中的產(chǎn)生速率、H2O2和MDA 含量均顯著增加;施加5 ～10 μmol/L核黃素后，產(chǎn)生速率及H2O2和MDA 含量顯著降低，表明核黃素與EBR 作用類似，施加低濃度(5 ～10 μmol/L) 核黃素能有效抑制植物細(xì)胞膜脂過氧化，有提高杜梨耐鹽能力的潛能。

SOD 是植物體內(nèi)清除活性氧的第一道防線［38-39］，植物的耐鹽性與SOD 活性的強(qiáng)弱直接相關(guān)［40-41］，它的主要功能為催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成過氧化氫( H2O2) ，H2O2進(jìn)一步通過CAT、POD 等抗氧化酶轉(zhuǎn)化為水和氧氣而被清除［42］。同時(shí)CAT、POD、APX 和GR 是AsA-GSH 循環(huán)不可或缺的組成部分。GSH-Px 可以清除由活性氧和OH·－誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。外源ALA 處理可提高鹽脅迫下菠菜和油菜葉片中SOD、POD、CAT 和APX 的活性，這可能是因?yàn)锳LA 是血紅素生物合成的前體，外源ALA 處理促進(jìn)了血紅素蛋白分子的活性［5，43］。而本試驗(yàn)觀察到10 μmol/L核黃素處理后，杜梨葉片中抗氧化酶( SOD、POD、CAT、GR、GSH-Px 和APX) 活性都較鹽脅迫處理和無鹽脅迫對(duì)照植株顯著增強(qiáng)，這可能與核黃素衍生物FAD 是許多抗氧化酶輔助因子有關(guān)［7］，從而顯著降低活性氧含量，減輕膜質(zhì)過氧化程度( 丙二醛含量下降) 。由此可見，核黃素處理能顯著提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫的防御能力，避免植物體受到傷害。

GSH 和AsA 是最主要的抗氧化物質(zhì)，通過參與AsA-GSH 循環(huán)將H2O2轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞無害的水和氧氣從而維持細(xì)胞功能［12］。施用外源油菜素內(nèi)酯( EBR) 可以提高鹽脅迫下小麥中抗氧化物質(zhì)( GSH和AsA) 的含量，增強(qiáng)活性氧清除能力而保護(hù)植物細(xì)胞［4］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施加5 ～10 μmol/L核黃素后，GSH 含量較鹽脅迫處理和對(duì)照均顯著升高; 10 μmol/L核黃素處理后，葉片AsA 含量較單純鹽脅迫處理顯著升高。產(chǎn)生的大量AsA 和GSH 參與AsAGSH 循環(huán)代謝，APX 活性增加，將AsA 作為電子供體使H2O2生成水的能力增強(qiáng)，產(chǎn)生的脫氫抗壞血酸( DHA) 通過GSH 作為電子供體再次生成AsA，其產(chǎn)物氧化型谷胱甘肽( GSSG) 通過GR 又轉(zhuǎn)變成GSH，經(jīng)過這一系列循環(huán)反應(yīng)來清除活性氧［44］，從而對(duì)植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)起到保護(hù)作用。

眾所周知，植物體中抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)，它們都參與植物體中的抗氧化反應(yīng)，清除活性氧，因此抗氧化酶活性與抗氧化物質(zhì)和活性氧含量在植物體中是息息相關(guān)的。核黃素及其衍生物FAD 和FMN 是植物光合作用、能量生成和氧化還原代謝不可或缺的組成部分［7］。雖然核黃素是一種光敏劑，在曝光下可以生成單線態(tài)氧和超氧化物陰離子［45-46］，從而誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生活性氧［9，43］，但是核黃素衍生物FAD 是許多抗氧化酶調(diào)節(jié)清除H2O2所必需的輔酶［47-48］?；钚匝踉谥参矬w中的作用亦與其含量相關(guān)，低濃度活性氧可以調(diào)節(jié)誘導(dǎo)逆境防御基因，而高濃度活性氧會(huì)破壞細(xì)胞穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［49-51］。因此核黃素對(duì)植物體抗氧化系統(tǒng)的影響是復(fù)雜的。本研究結(jié)果顯示: 200 mmol/L NaCl 鹽脅迫下施加10 μmol/L核黃素后，杜梨幼苗活性氧產(chǎn)生速率、H2O2和MDA 含量較單純鹽脅迫處理顯著降低，而抗氧化酶( SOD、POD、CAT、GR、GSH-Px 和APX) 活性和抗氧化物質(zhì)( GSH和AsA) 含量均較單純鹽脅迫處理顯著增高。結(jié)合核黃素及活性氧的生理作用，可以推測(cè)本研究中，核黃素主要通過控制活性氧產(chǎn)生量來調(diào)節(jié)植物體中的抗氧化系統(tǒng)，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，200 mmol/L 鹽脅迫下施加低濃度(5 ～10 μmol/L) 核黃素可以有效緩解杜梨葉片的氧化傷害，具體表現(xiàn)為活性氧含量顯著降低，膜質(zhì)過氧化程度減輕，抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量增加，該過程主要與核黃素參與的活性氧代謝相關(guān)。

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