蘇丹草管狀分子體外誘導(dǎo)及木質(zhì)素合成相關(guān)酶活力的變化

劉兆明， 鐘小仙， 錢 晨， 劉大林

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州225009; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014)

植物的次生細(xì)胞壁主要沉積在包括木質(zhì)部中起輸導(dǎo)和支持功能的細(xì)胞中，如管胞和導(dǎo)管分子，二者統(tǒng)稱為管狀分子，管狀分子是一種無原生質(zhì)體、壁加厚的非生活細(xì)胞，為植物木質(zhì)部輸導(dǎo)結(jié)構(gòu)，兼具支持功能，存在于所有維管植物中，分化成熟過程中會發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，形成特征性的加厚的次生細(xì)胞壁。自1975 年Kohlenbach 等［1］首次發(fā)現(xiàn)百日草( Zinnia elegans L.) 機械分離的單個葉肉細(xì)胞可以直接分化形成管狀分子后，迄今已建立了百日草［2］、擬南芥［Arabidopsis thaliana ( Linn.) Heynh.］［3］、煙草( Nicotianatabacum L.)［4］、楊樹( Populus tremula ×P.tremuloides)［5］、輻射松( Pinus radiate D. Don)［6］和花旗松( Pseudostuga mensziesii)［7］等的管狀分子體外誘導(dǎo)體系，為植物次生細(xì)胞壁及其木質(zhì)素合成機制研究提供了簡單有效的模式系統(tǒng)，但C4 作物管狀分子體外誘導(dǎo)體系尚未見報道。

木質(zhì)素是一種酚類聚合物，在管狀分子分化成熟過程中不斷摻入次生細(xì)胞壁中，從而增加細(xì)胞壁的硬度。木質(zhì)素由香豆醇、松柏醇、芥子醇3 種單體在多種酶綜合調(diào)控下聚合而成。苯丙氨酸解氨酶( PAL) 是限速酶，對木質(zhì)素的合成起總開關(guān)的作用;肉桂醇脫氫酶( CAD) 催化松柏醇和芥子醇單體合成的最后一步反應(yīng)，是木質(zhì)素合成的重要調(diào)節(jié)酶;過氧化物酶( POD) 催化木質(zhì)素單體聚合過程，參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素在細(xì)胞壁的沉積［8］?？扇苄苑尤┙M分為植物次生細(xì)胞壁與木質(zhì)素合成過程的中間物質(zhì)［9］。研究次生細(xì)胞壁合成過程中木質(zhì)素含量及其相關(guān)酶活性的變化，對解析次生細(xì)胞壁合成機制及植物定向改良具有重要意義。

蘇丹草［Sorghum sudanense( Piper.) Stapf.］為禾本科( Poaceae) 高粱屬( Sorghum) 牧草［10-11］，具有生物產(chǎn)量高、耐貧瘠、抗干旱、可多次刈割及光合效率高的特性，作為能飼糧兼用型禾本科C4 作物正日益受到世界各國的重視［12-13］。本研究以蘇丹草新品系蘇牧3 號愈傷組織為材料，通過研究光照培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基中有無植物激素和不同活性炭濃度對管狀分子分化率的影響，建立蘇丹草管狀分子體外誘導(dǎo)技術(shù)體系，并通過研究管狀分子誘導(dǎo)過程中木質(zhì)素含量、可溶性酚醛組分含量及其相關(guān)酶活力變化，探索蘇丹草次生細(xì)胞壁與木質(zhì)素合成調(diào)控機制，為蘇丹草定向育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇丹草新品系蘇牧3 號淡黃色愈傷組織，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基成分

基本培養(yǎng)基由MS 大量元素、MS 微量元素［14］、B5有機成分［15］組成，添加蔗糖30 g/L、瓊脂條8 g/L，培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH 值至5.8。

愈傷組織繼代培養(yǎng)基SM: 在基本培養(yǎng)基中添加2，4-D 2.0 mg/L和6-BA 0.05 mg/L;管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)基( TEM 和TESM) : 在基本培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基中分別添加0 g/L、1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L的活性炭( 表1) 。

1.3 管狀分子分化率的測定方法

將繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d 的淡黃色顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入不同的管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個處理設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)接種4 瓶，每瓶接種20 塊愈傷組織，分別在黑暗和每天16 h 光照條件下培養(yǎng)28 d。管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)期間，每隔2 d 取樣，每個重復(fù)隨機選取2 塊愈傷，用刀片分別切取愈傷組織塊表面2 mm 的部分，10% NaOH 浸泡過夜后蒸餾水沖洗3 次，用0.01%番紅染色30 min，光學(xué)顯微鏡明場下進(jìn)行圖像采集，每塊愈傷組織隨機挑選10個圖像進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和管狀分子分化率的測定，管狀分子分化率計算公式如下:

管狀分子分化率=圖像中管狀分子總數(shù)/圖像中細(xì)胞總數(shù)×100%。

表1 管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方Table 1 Concentration of activated carbon in the media

1.4 管狀分子形態(tài)學(xué)特征的觀察

用光學(xué)顯微鏡對管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)期間的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察，并將采集的圖像進(jìn)行管狀分子形態(tài)特征分析。

1.5 可溶性酚醛組分含量與木質(zhì)素含量分析

以黑暗條件下繼代培養(yǎng)的愈傷組織和最適宜的管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的愈傷組織為材料，每隔3 d 取樣，參照M?ller 等［9］的方法，進(jìn)行可溶性酚醛組分含量和木質(zhì)素含量測定，參照Krishnamurthy 等［16］的方法，對最適宜的管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的愈傷組織，采用間苯三酚進(jìn)行木質(zhì)素特異染色，用數(shù)碼相機進(jìn)行圖像采集。

1.6 PAL、CAD、POD 活力的測定

以黑暗條件下繼代培養(yǎng)的愈傷組織和最適宜的管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的愈傷組織為材料，每隔3 d 取樣，PAL 活力測定參照Edwards 等［17］的方法; CAD 活力測定參照Wyrambik 等［18］的方法;POD 活力測定采用POD( 植物) 試劑盒( 購自南京建成生物工程研究所) 。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SAS9.2 軟件進(jìn)行方差分析，采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 光照、外源植物激素和活性炭對愈傷組織管狀分子分化率的影響

將繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d 的淡黃色顆粒狀愈傷組織( 圖1) 轉(zhuǎn)入不同的管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在黑暗和每天16 h 光照條件下培養(yǎng)。結(jié)果見圖2。

圖1 繼代培養(yǎng)28 d 的愈傷組織Fig.1 Calli subcultured for 28 d of sudangrass

在各種不同的培養(yǎng)基上，每天16 h 光照條件培養(yǎng)的愈傷組織管狀分子分化率為 17.15% ～51.97%，平均值為33.60%，黑暗條件下培養(yǎng)的愈傷組織管狀分子分化率為0 ～34.9%，平均值為20.36%，每天光照16 h 培養(yǎng)極顯著提高了愈傷組織的管狀分子分化率( P ＜0.01) 。

在不含外源植物激素的基本培養(yǎng)基中，添加不同濃度活性炭培養(yǎng)的愈傷組織管狀分子分化率為0 ～51.97%，平均值為26.00%。在含外源植物激素的繼代培養(yǎng)基中，添加不同濃度的活性炭，培養(yǎng)的愈傷組織管狀分子分化率為0 ～45.54%，平均值為27.95%，二者差異不顯著( P ＞0.05) 。

進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時有無光照、培養(yǎng)基中是否含外源植物激素和培養(yǎng)基中不同活性炭濃度對愈傷組織管狀分子分化率的影響存在極顯著的交互作用，以不含外源植物激素的基本培養(yǎng)基中添加3 g/L 活性炭每天光照16 h 培養(yǎng)的處理( TEM3) 為管狀分子誘導(dǎo)最優(yōu)化培養(yǎng)條件，在此培養(yǎng)條件下愈傷組織管狀分子分化率最高，為51.97%。

黑暗培養(yǎng)條件下，選用不含外源植物激素的基本培養(yǎng)基或含外源植物激素的繼代培養(yǎng)基、不添加活性炭，對愈傷組織培養(yǎng)28 d，未觀察到管狀分子分化。每天光照16 h 培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)基處理愈傷組織管狀分子開始出現(xiàn)的時間為開始培養(yǎng)后4 ～6 d，管狀分子分化率達(dá)到最高值的時間為開始培養(yǎng)后18 ～26 d。

圖2 光照時間、外源植物激素和活性炭濃度組合對管狀分子分化率的影響Fig.2 Effect of illumination time duration，ogenous hormone and activated carbon concentration on differentiation rate of tracheary elements

2.2 愈傷組織中可溶性酚醛組分含量與木質(zhì)素含量變化

每天光照16 h、基本培養(yǎng)基中添加3 g/L活性炭試驗組，在誘導(dǎo)愈傷組織管狀分子分化過程中，可溶性酚醛組分含量隨誘導(dǎo)天數(shù)增加呈現(xiàn)先增后減的變化規(guī)律( 圖3) ，在培養(yǎng)第12 d 時達(dá)到最高( 1.09 μg/mg) ;黑暗條件、繼代培養(yǎng)基中不添加任何植物激素的對照組，愈傷組織中的可溶性酚醛組分含量為0.72 ～0.75 μg/mg，不同培養(yǎng)天數(shù)間無顯著差異;管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d 以前和21 d 以后，可溶性酚醛組分含量試驗組和對照組間無顯著差異，培養(yǎng)3 ～21 d時試驗組的可溶性酚醛組分含量均極顯著高于對照組。

每天光照16 h、基本培養(yǎng)基中添加3 g/L活性炭試驗組，木質(zhì)素含量隨管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)天數(shù)的增加極顯著提高( 圖4) ，管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 時木質(zhì)素含量達(dá)到最高( 18.11%) ，此后木質(zhì)素含量無顯著變化;黑暗條件、繼代培養(yǎng)基中不添加任何植物激素的對照組，愈傷組織中的木質(zhì)素含量為0.26% ～0.35%，不同培養(yǎng)天數(shù)間無顯著變化;試驗組管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d 以前與對照組的木質(zhì)素含量無顯著差異，其余培養(yǎng)時間試驗組的木質(zhì)素含量均極顯著高于對照組。

圖3 蘇丹草愈傷組織可溶性酚醛組分含量變化Fig.3 The change of soluble phenolic components contents in sudangrass calli

圖4 蘇丹草愈傷組織木質(zhì)素含量變化Fig.4 The change of lignin content in sudangrass calli

對每天光照16 h、基本培養(yǎng)基中添加3 g/L活性炭培養(yǎng)的愈傷組織塊及其勻漿液，采用鹽酸-間苯三酚進(jìn)行木質(zhì)素特異染色( 圖5) ，結(jié)果顯示，在愈傷組織管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 內(nèi)，隨培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織塊表面紅色面積逐漸增多，勻漿液紅顏色逐漸加深; 管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)24 d 和27 d 時，由于愈傷組織塊表面部分出現(xiàn)褐化，采用鹽酸-間苯三酚染色后愈傷組織塊表面和勻漿液呈紅褐色和棕褐色。

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)的管狀分子的形態(tài)特征

顯微觀察結(jié)果表明，大量管狀分子呈集團狀分布于愈傷組織細(xì)胞簇中( 圖6A) 。將視野放大，可以觀察到不同形態(tài)特征的單個管狀分子，主要有兩種類型:一種為兩頭尖、兩端不開口的管胞，另一種是伸長的、兩端開口的導(dǎo)管分子( 圖6B) ;同時，在視野中也可以觀察到處在不同發(fā)育階段的管狀分子:一是發(fā)育早期的管狀分子輪廓模糊，次生細(xì)胞壁增厚不明顯，骨架結(jié)構(gòu)不完整( 圖7A) ;二是發(fā)育中期的管狀分子輪廓結(jié)構(gòu)清晰，但骨架結(jié)構(gòu)還不完整，次生細(xì)胞壁明顯加厚( 圖7B) ;三是發(fā)育成熟的管狀分子骨架結(jié)構(gòu)完整，次生細(xì)胞壁顯著增厚，形成不同類型的紋孔( 圖7C) 。成熟的管胞類型中絕大部分為網(wǎng)狀管胞( 圖7F) ，還有部分梯狀管胞( 圖7D) 。還可以觀察到成熟管胞以其傾斜的兩端相互連接形成的輸導(dǎo)組織( 圖7E) ; 導(dǎo)管分子大部分為網(wǎng)狀類型( 圖7G) ，也可以觀察到少量孔狀類型( 圖7H) ，大量發(fā)育成熟的導(dǎo)管分子通過端壁的穿孔相互連接形成導(dǎo)管( 圖7I) 。

2.4 愈傷組織中PAL、CAD、POD 活力變化

每天光照16 h、基本培養(yǎng)基中添加3 g/L活性炭的試驗組，管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、18 d 和21 d 時，愈傷組織中的PAL 活力隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而顯著提高( 圖8) ，但PAL 活力誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d 與9 d 無顯著差異，但顯著低于12 d，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 時PAL 活力達(dá)到最高( 5.915 0 ×10-3U/mg) ，且隨后的誘導(dǎo)培養(yǎng)24 d、27 d 的愈傷組織中PAL 活力較誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 未發(fā)生顯著變化;黑暗培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)基中不添加活性炭的對照組，繼代培養(yǎng)3 d 和6 d 的愈傷組織中PAL 活力無顯著差異，但顯著高于初始培養(yǎng)時愈傷組織中PAL活力，黑暗條件、繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d，愈傷組織中的PAL 活力隨培養(yǎng)天數(shù)增加而降低，黑暗條件、繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d、24 d和27 d 間PAL 活力無顯著差異，但均極顯著低于黑暗條件、繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d 時的PAL 活力;PAL 活力試驗組管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d 時開始極顯著高于對照組。

每天光照16 h、基本培養(yǎng)基中添加3 g/L活性炭的試驗組，管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)0 d、3 d、6 d、9 d 時，愈傷組織中的CAD 活力隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而極顯著提高( 圖9) ; 管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)9 d、12 d、15 d 時，愈傷組織中的CAD 活力無顯著差異，但均極顯著高于管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d 時的CAD活力; 管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 時，CAD 活力最高( 8.366 7 ×10-2U/mg) ，但與管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)18 d、24 d、27 d 時的CAD 活力無顯著差異。黑暗條件、繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d 時，愈傷組織中的CAD 活力最高，其余培養(yǎng)天數(shù)間CAD 活力無顯著差異; CAD 活力試驗組管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d 時開始極顯著高于黑暗條件、繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照組。

每天光照16 h、基本培養(yǎng)基中添加3 g/L 活性炭的試驗組，管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d、6 d、9 d時，愈傷組織中的POD 活力隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而極顯著提高( 圖10) ，且管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)9 d時POD 活 力 達(dá) 到 最 高( 132. 24 U/mg) ，此 后POD 活力都極顯著高于黑暗繼代培養(yǎng)的對照組;黑暗繼代培養(yǎng)的愈傷組織，除培養(yǎng)3 d 時的POD活力最低外，其余培養(yǎng)天數(shù)間POD 活力均無顯著差異。

圖5 管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)0 ～27 d 的愈傷組織塊及其勻漿液鹽酸間苯三酚染色圖片F(xiàn)ig.5 Calli and their homogenate stained with phloroglucinol-HCl after 27-d induction

圖6 蘇丹草愈傷組織誘導(dǎo)的管狀分子Fig.6 Tracheary elements induced in sudangrass calli

圖7 蘇丹草愈傷組織誘導(dǎo)的管狀分子類型Fig.7 Types of tracheary elements induced in sudangrass calli

圖8 蘇丹草愈傷組織PAL 活力變化Fig.8 The change of PAL activity in sudangrass calli

圖9 蘇丹草愈傷組織CAD 活力變化Fig.9 The change of CAD activity in sudangrass calli

圖10 蘇丹草愈傷組織POD 活力變化Fig.10 The change of POD activity in sudangrass calli

3 討論

Mizuno 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，光照對胡蘿卜( Daucus carota L.) 根外植體管狀分子分化是必需的，胡蘿卜根外植體只有在光照培養(yǎng)條件下才能正常生長和進(jìn)行管狀分子分化。冰葉日中花( Mesembryanthemum crystallinum L.) 愈傷組織也只有在光照培養(yǎng)條件下才出現(xiàn)管狀分子分化，管狀分子分化率為20%［20］。M?ller 等［5］研究指出，光照對輻射松( Pinus radiate D. Don) 愈傷組織體外管狀分子分化是非必需的，在添加2 g/L活性炭不含植物激素的培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)條件下管狀分子分化率可達(dá)12.63%，M?ller等［21］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在添加2 g/L活性炭不含植物激素培養(yǎng)基中，每天光照24 h 培養(yǎng)條件下管狀分子分化率達(dá)到31.75%。本研究結(jié)果表明，光照對蘇丹草愈傷組織管狀分子分化是非必需的，每天光照16 h 和黑暗培養(yǎng)條件下管狀分子分化率的平均值分別為33.60%和20.36%，每天光照16 h 培養(yǎng)可以極顯著提高蘇丹草管狀分子分化率。

植物激素作為植物組織培養(yǎng)必需的營養(yǎng)成分，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)比例的植物激素可以維持離體培養(yǎng)細(xì)胞正常的生長和發(fā)育。在植物管狀分子體外誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)基中是否含有植物激素也會影響體外管狀分子的分化率。M?ller 等［5，21］研究發(fā)現(xiàn)，在每天光照24 h、不含活性炭和植物激素的培養(yǎng)基中，輻射松管狀分子分化率為32.26%，若在培養(yǎng)基中添加4.5 μmol/L 2，4-D 和2.6 μmol/L 6-BA，管狀分子分化率將低于1%。Oda 等［3］利用擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行體外管狀分子分化研究時發(fā)現(xiàn)，2，4-D 會抑制管狀分子分化，用不含2，4-D 的液體培養(yǎng)基沖洗懸浮細(xì)胞4 次，在培養(yǎng)基中添加0 μmol/L、0.04 μmol/L、0.41 μmol/L、4.10 μmol/L 2，4-D，結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)168 h 時，2，4-D 濃度為0 μmol/L處理的管狀分子分化率為30%，而2，4-D 濃度為4.10 μmol/L處理的無管狀分子產(chǎn)生。百日草葉肉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中，添加0.1 mg/L NAA和1 mg/L 6-BA，管狀分子的分化率可達(dá)到30%［22］，添加0.1 μmol/L NAA 和0. 2 μmol/L 6-BA，誘導(dǎo)的管狀分子分化率為25% ～40%［23］，添加0.5 μmol/L NAA 和0. 5 μmol/L 6-BA，百日草管狀分子的分化率最高達(dá)53%［24］。活性炭是植物組織培養(yǎng)常用的介質(zhì)，具有強烈的吸附性能，可以吸附植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，同時也可以吸附添加到培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和植物激素等，從而對培養(yǎng)物的發(fā)育、生長和分化產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用［25］。M?ller 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在含有4.5 μmol/L 2，4-D 和4.4 μmol/L 6-BA 的輻射松懸浮培養(yǎng)體系中未添加活性炭，沒有出現(xiàn)管狀分子分化，而在不含植物激素的培養(yǎng)基中添加2 g/L活性炭，誘導(dǎo)培養(yǎng)18 d 時管狀分子分化率可達(dá)18%。Yamagishiy等［26］研究指出，暗培養(yǎng)條件下，在不含植物激素的培養(yǎng)基中添加5 g/L的活性炭，日本榧樹和日本柳杉誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周，管狀分子分化率可以達(dá)到47.2%和31.0%，均顯著高于未添加活性炭處理的管狀分子分化率。本研究結(jié)果表明，植物激素和活性炭之間具有顯著的交互作用，在每天光照16 h 培養(yǎng)條件下，以不含植物激素的基本培養(yǎng)基中添加3 g/L活性炭時管狀分子分化率最高( 51.97%) ; 在暗培養(yǎng)條件下，以含有2.00 mg/L 2，4-D + 0.05 mg/L 6-BA的繼代培養(yǎng)基中添加5 g/L活性炭時管狀分子分化率最高(34.79%) 。

管狀分子在分化過程中會發(fā)生明顯的次生細(xì)胞壁加厚，形成網(wǎng)狀、螺旋狀、孔狀、梯狀、環(huán)狀等多種類型的紋孔［9］，其中木質(zhì)素的沉積是次生細(xì)胞壁形成過程中的標(biāo)志性動作［27］，木質(zhì)素沉積是多種酶綜合調(diào)控的結(jié)果，到目前為止，大部分參與木質(zhì)素合成調(diào)控的酶都已被鑒定和分離，并進(jìn)行了相關(guān)功能分析［28］。陳永忠等［29］研究指出，植物細(xì)胞壁在形成過程中會發(fā)生木質(zhì)化，木質(zhì)素會逐步摻入到細(xì)胞壁中，使細(xì)胞壁的硬度增加，起到支持植物體的作用。M?ller 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在輻射松管狀分子分化過程中利用紫外吸收光譜的方法發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞外存在數(shù)量較多的液滴狀物質(zhì)，統(tǒng)稱為可溶性酚醛組分［30］，其在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)先增后減的變化規(guī)律，在誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d 時達(dá)到最高值，經(jīng)間苯三特異性染色呈現(xiàn)紅色，證明與木質(zhì)素同源，都含有芳醛結(jié)構(gòu)，而芳醛是木質(zhì)素合成的前體物質(zhì); 木質(zhì)素含量隨管狀分子誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的增加持續(xù)升高，在誘導(dǎo)培養(yǎng)18 d時達(dá)到最高值(18%) 。Sato 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，在利用百日草葉肉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行管狀分子誘導(dǎo)過程中，PAL 和CAD 活力會伴隨管狀分子次生壁的不斷木質(zhì)化而顯著升高; M?ller 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，輻射松愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d 時誘導(dǎo)率達(dá)到最高(45%) ，PAL 活力從誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d 開始顯著升高，在誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d 時達(dá)到最高值，之后PAL 活力無顯著變化;CAD 活力在誘導(dǎo)培養(yǎng)第9 d 時達(dá)到最高值。Zwliha 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，在楊樹中反向轉(zhuǎn)入POD Shpx6a 基因，木質(zhì)素含量降低，證明了POD 確實與木質(zhì)素單體的聚合有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，蘇丹草誘導(dǎo)形成的管狀分子次生壁加厚大部分呈現(xiàn)網(wǎng)狀，同時還有少量的梯狀管胞和孔狀導(dǎo)管分子; 可溶性酚醛組分含量隨誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的增加先升后降，誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d 之后含量顯著降低，與M?ller 等［9］在輻射松管狀分子分化過程中的研究結(jié)果相似; 從誘導(dǎo)培養(yǎng)第3 d 開始PAL 和CAD 活力顯著升高，在誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 時同時達(dá)到最高值，木質(zhì)素含量在誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 時達(dá)到最高值(18.11%) ，之后木質(zhì)素含量及PAL、CAD 活力都無顯著變化，而POD 活力始終維持在較高的水平。由此可見，PAL、CAD、POD 活力與蘇丹草體外管狀分子誘導(dǎo)過程中木質(zhì)素的合成具有顯著的相關(guān)性。

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