蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定及性腺激素對(duì)其增殖的影響

葉幼榮， 張 璐， 孫 杰， 桑永明， 趙宗勝

( 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子832003)

蛋雞的子宮為囊狀，是輸卵管的一部分，含管狀腺，分泌蛋白質(zhì)、鈣質(zhì)和色素，其主要生理功能是形成蛋殼。子宮內(nèi)膜由單層柱狀上皮和固有層構(gòu)成，而上皮主要由具有分泌功能的腺上皮構(gòu)成; 固有層則由子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)構(gòu)成，子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞可受卵巢激素的影響產(chǎn)生周期性的變化。在不同的生理周期，孕酮( P4) 和雌激素( E2) 的聯(lián)合作用使子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生形態(tài)及生物化學(xué)的變化，這種變化不僅表現(xiàn)在內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化，同時(shí)還表現(xiàn)在其增殖及分泌活性的改變。性激素由受體介導(dǎo)調(diào)控生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和功能。受體是通過(guò)調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)錄因子和目標(biāo)基因來(lái)驅(qū)動(dòng)生理變化的［1-2］。性激素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外增殖也有影響，Pierro 等［3］研究結(jié)果指出雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的體外增殖有促進(jìn)作用。

對(duì)于哺乳動(dòng)物( 如大鼠［4］、豬［5］、兔［6］、猴［7］、人［8］) 以及反芻動(dòng)物［9-10］已有子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化的報(bào)道，而蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和純化國(guó)內(nèi)未有明確報(bào)道。為了探討蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及性激素對(duì)其體外增殖的影響，本研究采用Ⅰ型膠原酶消化的方法對(duì)蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，測(cè)定不同濃度的孕酮和雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外增殖的影響，為今后蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、分化及代謝的研究提供理想的體外模型，也為性激素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用機(jī)理的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇處于產(chǎn)蛋高峰期，生長(zhǎng)良好，產(chǎn)蛋率達(dá)80%以上的海蘭褐殼蛋雞作為試驗(yàn)動(dòng)物，試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)站。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12 混合培養(yǎng)液( Hy-Clone 公司) 、無(wú)支原體胎牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)) 、I 型膠原酶( 索萊寶公司生產(chǎn)) 、青鏈霉素混合液( Solarbio 公司生產(chǎn)) 、3-( 4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴鹽( MTT) 試劑( Solarbio 公司生產(chǎn)) 、二甲亞砜( DMSO) ( Biosharp公司生產(chǎn)) 、孕酮( P4，Sigma) 、雌激素( E2，Sigma) 、角蛋白ck18( Cytoker tin 18，北京中杉公司生產(chǎn)) 單克隆抗體、波形蛋白質(zhì)單克隆抗體( 北京中杉公司生產(chǎn)) 、SP 免疫組化試劑盒及DAB 顯色液( 北京中杉公司生產(chǎn)) 。

1.2 方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的獲取(1) 剪碎法: 無(wú)菌取出蛋雞子宮，剔除血管、結(jié)締組織和子宮內(nèi)膜表皮層，于超凈臺(tái)內(nèi)撕取子宮內(nèi)膜，用無(wú)菌的PBS 清洗3 ～5 次，剪碎成l mm3左右的小塊，加入終濃度為1 mg/ml的I 型膠原酶，置37 ℃消化60 min，加血清終止消化，并用200 目的細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，如此重復(fù)離心洗滌2 次。離心管中的細(xì)胞沉淀加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸，反復(fù)輕輕吹打混合均勻。用0.1%臺(tái)盼藍(lán)檢查細(xì)胞存活率，當(dāng)細(xì)胞存活率達(dá)90%以上進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分離的細(xì)胞以1 cm36 ×105個(gè)培養(yǎng)于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代，純化后的基質(zhì)細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)皿( 直徑5 cm) 、6 孔培養(yǎng)板，置5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)，其中6 孔培養(yǎng)板中放有處理過(guò)的蓋玻片( 細(xì)胞爬片) ，隔天換液，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，該法分離培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，鑒定后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。(2) 刮取法: 無(wú)菌取出蛋雞子宮，用手術(shù)刀片刮取子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，加入終濃度為1 mg/ml的I 型膠原酶于37 ℃消化60 min，之后處理方法同剪碎法，該法分離培養(yǎng)的細(xì)胞為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，鑒定后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞爬片及免疫組織化學(xué)鑒定 培養(yǎng)到第3 d 或4 d，6 孔板中的細(xì)胞在蓋玻片上完全貼壁后，取出蓋玻片進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液( PBS) 沖洗3 遍，吸干后用4% 的多聚甲醛室溫固定20 min，對(duì)刮取法和剪碎法得到的細(xì)胞爬片分別做鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法( SP法) 鑒定，分別用細(xì)胞角蛋白質(zhì)ck18 單克隆抗體和波形蛋白質(zhì)單克隆抗體作為一抗，二氨基聯(lián)苯胺( DAB) 顯色液顯色后在熒光顯微鏡下觀察試驗(yàn)結(jié)果，凡細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色的為陽(yáng)性細(xì)胞，用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察及生長(zhǎng)曲線測(cè)定 每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。MTT 法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:2 種方法得到的細(xì)胞以每孔1 ×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積為200 μl，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24 h 更換培養(yǎng)液并選擇8 個(gè)孔，每孔加入20 μl MTT 溶液( 5 mg/ml) ，37 ℃繼續(xù)孵育4 h 后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，各孔加入150 μl 二甲亞砜( DMSO) 溶液，微量振蕩器上震動(dòng)10 min 后在酶標(biāo)儀上于490 nm 處測(cè)定各孔OD 值，記錄結(jié)果。連續(xù)測(cè)定8 d，以時(shí)間為橫軸，光吸收值( OD 值) 為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 性腺激素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響 96孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行分組，分為空白組( 沒(méi)有細(xì)胞，只加PBS) 、對(duì)照組( 不添加激素) 和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組共分為9 組，各組培養(yǎng)液中雌激素( E2) 和孕酮( P4) 濃度見(jiàn)表1，每個(gè)濃度5 個(gè)重復(fù)。隔天換液，重新加入含相同濃度激素的培養(yǎng)液，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。若細(xì)胞狀態(tài)良好，3 d 后做MTT實(shí)驗(yàn)，于492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)OD 值。

表1 處理組的雌激素(E2)和孕酮(P4)濃度Table 1 The concentrations of estrogen (E2) and progesterone (P4)in the experimental treatments

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)胞生長(zhǎng)情況:2 種方法獲取的細(xì)胞接種36 h后80%的貼壁。采用刮取法培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞大多數(shù)為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，摻雜著極少量基質(zhì)細(xì)胞，上皮細(xì)胞呈多角形或橢圓形，邊界清楚，排列緊密，胞漿飽滿，核圓大，呈旋渦狀生長(zhǎng)( 圖1) 。采用剪碎法培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞多數(shù)為子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)為梭形或多邊形，呈平行束狀或放射狀排列，核明顯( 圖2) 。

圖1 刮取法培養(yǎng)48 h 的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞( ×100)Fig.1 The morphology of chicken endometrial epithelial cells cultured for 48 h by scraping ( ×100)

圖2 剪碎法培養(yǎng)48 h 的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞( ×100)Fig.2 The morphology of chicken endometrial stromal cells cultured for 48 h by cutting ( ×100)

2.2 細(xì)胞爬片的免疫組化結(jié)果

2 種細(xì)胞爬片進(jìn)行SP 法免疫組化鑒定后，結(jié)果顯示上皮細(xì)胞對(duì)角蛋白質(zhì)抗體呈陽(yáng)性，基質(zhì)細(xì)胞對(duì)波形蛋白質(zhì)抗體呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)95%。

2.3 MTT 法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在接種后最初24 h 生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)的第2 ～5 d 是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后生長(zhǎng)緩慢，第7 d 開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期;子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞最初的生長(zhǎng)趨勢(shì)同上皮細(xì)胞，在培養(yǎng)的第2 ～6 d 是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，之后生長(zhǎng)緩慢進(jìn)入平臺(tái)期( 圖3) 。

2.4 雌激素(E2)、孕酮(P4) 對(duì)蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外增殖的影響

圖3 蛋雞子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞MTT 生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of endometrial epithelial and stromal cells isolated from laying hens by MTT assay

96孔板中培養(yǎng)的2種細(xì)胞在加入不同濃度的E2和P4后出現(xiàn)了不同的增殖變化( 表2) 。由表2可知: 與對(duì)照相比，高濃度的雌激素( 100 nmol/L) 和孕酮( 100 nmol/L) 能夠顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的體外增殖; 10 nmol/L、100 nmol/L的雌激素分別和100 nmol/L孕酮合用對(duì)上皮細(xì)胞的體外增殖有顯著促進(jìn)作用。高濃度的孕酮( 100 nmol/L) 能顯著促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的體外增 殖; 100 nmol/L 孕 酮 和10 nmol/L、100 nmol/L雌激素的組合對(duì)基質(zhì)細(xì)胞體外增殖也有顯著促進(jìn)作用。這表明高濃度的孕酮和雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞體外增殖均有顯著促進(jìn)作用。

表2 不同濃度雌激素(E2)和孕酮(P4)對(duì)蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effects of E2 and P4 on the proliferation of epithelium and stromal cells isolated from chicken endometrium

3 討論

蛋雞的子宮實(shí)質(zhì)是個(gè)蛋殼腺，蛋殼在此形成，影響蛋雞子宮內(nèi)膜生理功能的因素有很多，由于體內(nèi)研究受多種條件的限制，成功培養(yǎng)蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞成為開(kāi)展多項(xiàng)相關(guān)研究的基礎(chǔ)，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞的培養(yǎng)未見(jiàn)明確報(bào)道。前人的研究已獲得高純度的牛［11］、犬［12］、馬［13］和兔［14］等哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，關(guān)于人的子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)也有大量研究［15-16］。本研究采用刮取法和Ⅰ型膠原酶消化法分離子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，去掉子宮內(nèi)膜表層后，剪碎法和消化法分離得到基質(zhì)細(xì)胞，由于在胰蛋白酶的作用下，基質(zhì)細(xì)胞較上皮細(xì)胞更易脫落，因此將培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶在37 ℃消化后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)以純化細(xì)胞。

細(xì)胞角蛋白質(zhì)ck18 是表皮細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，而波形蛋白質(zhì)廣泛存在于間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)免疫組化試驗(yàn)鑒定所培養(yǎng)的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分別對(duì)角蛋白質(zhì)抗體和波形蛋白質(zhì)抗體呈陽(yáng)性，這一結(jié)果與陳秀荔等［17］鑒定家兔子宮內(nèi)膜細(xì)胞的結(jié)果相同。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果表明，上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在接種后第1 d 為潛伏生長(zhǎng)期，從第2 d 開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5 d 到6 d 生長(zhǎng)逐漸緩慢下來(lái)，第7 d進(jìn)入平臺(tái)期。這一結(jié)果與宋宇軒等［18］關(guān)于家兔子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果相一致。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋雞子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的體外生長(zhǎng)趨勢(shì)是相似的，這為蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞的進(jìn)一步相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。

子宮內(nèi)膜在體內(nèi)受到雌激素、孕酮等的共同作用，子宮局部的微環(huán)境隨發(fā)情周期及生殖周期有規(guī)律的變化，大量的研究結(jié)果證明性腺激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖［16，19］、分化以及激素受體表達(dá)都具有重要調(diào)節(jié)作用［20-21］。有研究結(jié)果［22］表明鵝體內(nèi)孕酮、雌激素分泌水平從性成熟后開(kāi)始增高，一直到產(chǎn)蛋高峰期達(dá)到峰值，這種變化對(duì)鵝的產(chǎn)蛋有重要影響。關(guān)于激素對(duì)體外培養(yǎng)的蛋雞子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響還沒(méi)有廣泛研究。但是在哺乳動(dòng)物中，性腺激素對(duì)體外分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞的作用已有大量研究，阿依木古麗等［23］發(fā)現(xiàn)1 ×10-7mol/L和1 ×10-8mol/L 17 β-雌激素均能顯著增加牦牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖;Fa?kowska 等［24］研究結(jié)果表明，高濃度的孕酮( 10-5mol/L) 可顯著提高牛基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng); Slayden 等［25］用雌激素作用于獼猴子宮內(nèi)膜可促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞大量增殖。本研究采用不同濃度的雌激素和孕酮作用于體外培養(yǎng)的蛋雞子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果與對(duì)照相比，雌激素(100 nmol/L) 和孕酮(100 nmol/L) 能夠顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的體外增殖，孕酮(100 nmol/L) 能顯著促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的體外增殖，與宋宇軒等［18］利用孕酮和雌激素作用于家兔子宮內(nèi)膜細(xì)胞的研究結(jié)果一致。10 nmol/L和100 nmol/L的雌激素和100 nmol/L孕酮組合對(duì)上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的體外增殖有顯著促進(jìn)作用，與以往關(guān)于哺乳動(dòng)物類似研究的結(jié)果有所不同。本研究所使用的試驗(yàn)動(dòng)物是蛋雞，Bar［26］認(rèn)為雌激素調(diào)控蛋雞卵的形成和排出，雌激素和孕酮參與鈣代謝從而影響蛋殼的形成。雌激素在維持蛋雞輸卵管的功能上也是至關(guān)重要的，它促進(jìn)管狀腺的形成和上皮細(xì)胞的分化，表明性腺激素對(duì)蛋雞生殖過(guò)程的作用與哺乳動(dòng)物不同，我們的研究結(jié)果也反映了蛋雞和其他物種子宮間的生理差異。

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