兩個紅梨品種花色苷合成相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子MYB10 表達(dá)模式分析

田 鵬， 蘇艷麗， 康保珊， 魏聞東

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州450009)

紅色梨品種因?qū)俜N差異而表現(xiàn)出不同的著色模式。其中，西洋梨紅星(Pyrus communis CV.Starkrimson)和東方砂梨(P. pyrifolia)雜交種滿天紅［1］即是如此。紅星果實(shí)在整個發(fā)育期都保持全紅色，滿天紅幼果為綠色，后期經(jīng)光照果實(shí)陽面著紅色?？梢?，2 個品種最突出的差異在于著色的時間不同。梨果皮顏色主要由花色苷的組成和含量決定［2］?；ㄉ帐穷慄S酮代謝的終產(chǎn)物之一，其生物合成途徑已基本明確［3］。其中涉及多個參與編碼花色苷合成酶蛋白的基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT，這些基因的表達(dá)與花色苷的積累密切相關(guān)［3］。因此，研究不同著色模式的紅色梨果皮花色苷合成相關(guān)基因表達(dá)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控有利于揭示紅色梨的著色形成機(jī)制，進(jìn)而為紅色梨新品種選育和改良提供理論依據(jù)。目前，參與花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因在梨屬植物中已經(jīng)得以分離克隆［4］，并研究了這些基因在紅巴梨(Max Red Bartlett)和巴梨(Williams)［5］、滿天紅和奧冠紅梨［6］、早白蜜和云紅1 號［7］、紅星和滿天紅［8］中的表達(dá)特性，普遍認(rèn)為，紅色梨品種果皮花色苷的積累由各結(jié)構(gòu)基因協(xié)同控制。在花色苷合成調(diào)控因子方面，編碼轉(zhuǎn)錄因子MYB10 的基因已在紅色梨中分離克?。?］，研究證實(shí)，它的表達(dá)水平與結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄以及花色苷積累密切相關(guān)［5-6］。然而，前人的研究多在西洋梨或砂梨單屬種內(nèi)進(jìn)行，種間比較尤其是著色模式存在顯著差異的品種間比較幾乎很少涉及。紅色砂梨的研究多集中于套摘袋條件下，光照對花色苷合成基因表達(dá)變化的影響［6-7］，而果實(shí)在自然條件下的不同發(fā)育階段各基因的轉(zhuǎn)錄特性尚未見報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)著重研究西洋梨紅星和東方砂梨雜交種滿天紅兩種不同著色模式品種的果皮在果實(shí)的不同發(fā)育階段，參與編碼花色苷合成的酶蛋白基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT 以及轉(zhuǎn)錄因子MYB10 編碼基因的轉(zhuǎn)錄特性。通過比較，以期得出不同類型的紅色梨品種隨著果實(shí)發(fā)育和著色變化，及相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，并探討轉(zhuǎn)錄因子MYB10 對結(jié)構(gòu)基因表達(dá)和果皮花色苷含量累積的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

紅星梨(P. communis cv. Starkrimson)系中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所1988 年由新西蘭引入國內(nèi)的優(yōu)秀的全紅色西洋梨品種;滿天紅梨(P. pyrifolia CV. Mantianhong)是本所于1989 年選用日本幸水梨(Kosui)為母本，云南火把梨為父本人工雜交培育而成紅色梨優(yōu)良品種［1］。2 個品種成熟期不同，紅星為早熟品種，果實(shí)發(fā)育期約85 d，滿天紅為晚熟品種，果實(shí)發(fā)育期約136 d。

2 個梨品種的果實(shí)采自本所品種保存圃。在鄭州地區(qū)，紅星盛花期4 月10 日，滿天紅4 月5日，每個品種在各發(fā)育期的3 個不同階段進(jìn)行采摘，共6 個處理。2 個品種的采摘時間:紅星為花后25 d(5 月5 日)、58 d(6 月7 日)和78 d(6 月27 日);滿天紅為花后30 d(5 月5 日)、102 d(8 月15 日)和126 d(9 月8 日)。每個處理采30 個樣品果，10 個果為1 次重復(fù)，設(shè)3 次重復(fù)，采后削取果實(shí)著色部位最好的果皮(盡量不含果肉)，液氮冷凍，－80 ℃保存。

1.2 果皮花色苷的提取和含量測定

花色苷含量的測定在馬志本等［10］的方法上稍作改進(jìn)。果皮稱質(zhì)量后，加入1.0 ml 鹽酸甲醇(1%)提取液置于冰上進(jìn)行研磨;當(dāng)果皮呈勻漿狀時，再加入1.0 ml 提取液，在4 ℃的黑暗條件下浸提1 h;然后轉(zhuǎn)入1.5 ml 的離心管中，10 000 r/m離心5 min。最后取1.0 ml 上清液，稀釋至3 ml 測定D530、D620和D650值。計(jì)算花青苷的含量，以μg/g(鮮質(zhì)量)為單位表示。

1.3 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

樣品果皮總RNA 的提取方法參照李繼剛等［11］的改良熱硼酸法，DNaseⅠ消化后，用RevertAid premium first strand cDNA synthesis kit (Fermentas)按照試劑操作指南進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 熒光定量分析

利用熒光染料法進(jìn)行RT-PCR 和熒光定量分析，反應(yīng)體系采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas)按照試劑盒操作指南配置。PCR 反應(yīng)和熒光信號檢測在LightCycler 480(Roche)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，程序:95 ℃10 min，然后95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)。每個樣設(shè)置3 個平行，重復(fù)2 次試驗(yàn)，以Actin 為內(nèi)參 基 因 對 目 的 基 因(PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT 和MYB10)進(jìn)行相對定量分析，方法參考Pfaffl［12］，引物參照已公布的基因序列設(shè)計(jì)(表1)。

表1 熒光定量PCR 引物序列［4-6］Table 1 The primer sequence of qRT-PCR［4-6］

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS11.0 和Excel 2003 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 6.1 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 個梨品種果實(shí)花色苷含量分析

由于遺傳背景不同，2 個品種著色程度存在很大差異。紅星果實(shí)全紅，顏色深紫;滿天紅果實(shí)陽面著色，色澤鮮紅。在果實(shí)發(fā)育的整個階段，紅星果皮的花色苷含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于滿天紅。兩個品種在著色模式方面最明顯的區(qū)別在于:紅星幼果期時(花后25 d)全面著紅色，肉眼很難區(qū)分3 個發(fā)育階段果實(shí)外觀著色程度;而滿天紅幼果時(花后30 d)為綠色，著色過程存在一個轉(zhuǎn)色期(花后102 d 左右)，3 個發(fā)育階段外觀著色程度變化明顯。測定兩個品種果實(shí)3 個發(fā)育時期果皮中花色苷含量變化后發(fā)現(xiàn)，花色苷含量與果實(shí)外觀著色程度相一致。紅星花色苷含量在花后58 d 時最高，變化趨勢為先升高后降低;滿天紅則幼果時幾乎檢測不到花色苷，隨著發(fā)育，含量呈逐漸升高，在花后126 d 時最高(圖1)。

圖1 2 個梨品種不同果實(shí)發(fā)育期果皮花色苷含量變化Fig.1 Changes of anthocyanin contents in the skin of two pear varieties during fruit development

2.2 2 個梨品種果皮中花色苷合成基因的轉(zhuǎn)錄特性

2 個梨品種由于果皮花色苷含量不同，果實(shí)色澤表型差異顯著。為探明花色苷合成途徑與果實(shí)著色發(fā)生及程度的關(guān)系，本試驗(yàn)對參與花色苷合成的7 個結(jié)構(gòu)基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、F3GT進(jìn)行了實(shí)時熒光定量分析。結(jié)果(圖2)顯示，紅星果實(shí)發(fā)育期間，除PAL 外，其他基因都是在花后58 d 時表達(dá)量最高，基因表達(dá)量的變化趨勢與果皮花色苷含量的變化相一致，升高后降低，尤其下游基因DFR、ANS、F3GT，花后58 d 的表達(dá)量達(dá)到花后25 d的4 ～5 倍。滿天紅的基因表達(dá)量與果皮花色苷含量變化并不一致，除PAL 和F3GT 在花后102 d 時最高，呈升高后降低外，其他基因的表達(dá)量都隨果實(shí)的發(fā)育而逐漸降低，下游基因F3H、DFR 和ANS 在接近果實(shí)成熟時降到極低，而果實(shí)花色苷含量此時最高。比較2 個品種，整個果實(shí)發(fā)育期間，CHS 表達(dá)量滿天紅是紅星的10 倍以上。此外，果實(shí)發(fā)育初期，除PAL 和F3GT 外，其他基因的表達(dá)量滿天紅均高于紅星，而此時紅星著紅色，滿天紅為綠色。果實(shí)接近成熟時，滿天紅花色苷合成上游基因CHS、CHI的表達(dá)量高于紅星，而下游基因F3H、DFR、ANS 正好相反，這與我們以前的結(jié)果一致［8］。

2.3 2 個梨品種果皮中轉(zhuǎn)錄因子MYB10 的轉(zhuǎn)錄特性及對花色苷合成基因表達(dá)量的影響

2 個品種果皮中MYB10 基因在不同果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)量測定結(jié)果(圖2)顯示:紅星果皮中，MYB10 轉(zhuǎn)錄水平在整個發(fā)育期都很低，不隨結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量和花色苷含量的變化而不同;滿天紅果皮中，MYB10 基因表達(dá)量在轉(zhuǎn)色期(花后102 d)時最高，幼果期和接近果實(shí)成熟期差異不顯著，變化趨勢為升高后降低，與PAL 和F3GT 的變化趨勢相同。2個品種比較，MYB10 基因表達(dá)量滿天紅是紅星的50倍以上。

3 討論

3.1 不同紅色梨品種的著色模式差異

由于遺傳背景不同，紅色梨因種屬差異呈現(xiàn)出不同的著色模式，其中最顯著的差異之一就在于著色的時間不同。西洋紅色梨多花后幼果期著色，例如紅巴梨、早紅考蜜斯、紅星、Red d’Anjou、Bon Rouge 等;紅色砂梨幼果期為綠色，果實(shí)發(fā)育中后期著色，例如火把梨、滿天紅、奧冠、云紅1 號等。本研究的主要目的就在于探討紅星和滿天紅果實(shí)著色時間差異的分子機(jī)理，所以選擇3 個代表性果實(shí)發(fā)育期以簡化研究過程。之所以選擇滿天紅，是因?yàn)闈M天紅為火把梨的后代，繼承了親本的著色特征且克服了紅色砂梨品質(zhì)差不適推廣的缺陷，在生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，以滿天紅為研究對象更具應(yīng)用價值。

3.2 2 個梨品種花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)差異

西洋梨紅星在果實(shí)發(fā)育期著色程度變化的本質(zhì)是果皮花色苷含量的改變。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅星的花色苷含量隨果實(shí)發(fā)育先升高后降低，花色苷合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量除PAL 外與其呈相同的變化趨勢。這一結(jié)果與紅巴梨果皮中花色苷生物合成相關(guān)基因(CHS、CHI、DFR、F3H、ANS、F3GT)的表達(dá)量分析結(jié)果相一致［5］。因此，推測此類品種的果實(shí)著色程度由多基因協(xié)同作用。

紅色砂梨滿天紅著色時間在果實(shí)發(fā)育中后期，與西洋紅梨不同，存在一個從無到有的轉(zhuǎn)色過程，探討轉(zhuǎn)色期的成因?qū)τ诮沂竟麑?shí)著色機(jī)理有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，滿天紅果實(shí)著色轉(zhuǎn)色期的一個顯著特征是在其他花色苷合成基因表達(dá)量都下降的情況下，PAL 和F3GT 基因的表達(dá)量升高，這2 個基因?qū)M天紅的果實(shí)轉(zhuǎn)色異常重要。PAL 是花色苷合成代謝的第一個酶，前人研究結(jié)果表明［13］，在花色苷合成過程中，只有在缺少前體的條件下，花色苷合成才與PAL 活性有關(guān)。因此推測滿天紅果實(shí)著色轉(zhuǎn)變期PAL 表達(dá)量的升高可能是由于果實(shí)發(fā)育前期花色苷合成前體不足所致。F3GT 在不同著色蘋果中的表達(dá)分析結(jié)果表明［14］，它的表達(dá)量與蘋果顏色呈正相關(guān)，F(xiàn)3GT 是蘋果果皮紅色的關(guān)鍵基因之一。這與本文結(jié)果相一致，我們認(rèn)為F3GT 的表達(dá)對于滿天紅果皮著色與否非常關(guān)鍵。除了自然條件下的果實(shí)轉(zhuǎn)色，研究者也采用套摘袋技術(shù)，人為創(chuàng)造果實(shí)轉(zhuǎn)色。在套摘袋條件下，紅色砂梨品種滿天紅、奧冠、云紅1 號果皮花色苷合成結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄特性的研究已有報(bào)道［6-8］，它們的著色以及基因表達(dá)量變化與光照密切相關(guān)。對奧冠［6］和云紅1 號［7］的研究結(jié)果表明，果實(shí)去袋后，光照誘導(dǎo)DFR 和ANS 轉(zhuǎn)錄增多與花色苷含量升高一致。葡萄中也證實(shí)［15］，DFR 和ANS 啟動子序列中存在特定的結(jié)構(gòu)域，可受光照的誘導(dǎo)。這些結(jié)果在本試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)，可見，自然生長條件和套摘條件下的轉(zhuǎn)色存在不同的分子機(jī)制，除了光照是果實(shí)著色的調(diào)控因素外，還存在其他因素調(diào)控紅色砂梨滿天紅果皮顏色的轉(zhuǎn)變。

比較2 個品種，CHS 在滿天紅中的表達(dá)量明顯高于在紅星中的表達(dá)量。Zhang 等［7］在砂梨品種云紅1號與早白蜜構(gòu)建的差減cDNA 文庫中發(fā)現(xiàn)的唯一一個花色苷合成基因就是CHS?？梢姡珻HS 在紅色砂梨品種果皮花色苷累積中可能具有重要作用。此外，果實(shí)發(fā)育初期，除PAL 和F3GT 外，其他基因都是滿天紅高于紅星;果實(shí)接近成熟時，滿天紅花色苷合成上游基因CHS、CHI 的表達(dá)量高于紅星，而下游基因F3H、DFR、ANS 正好相反。這些基因在品種間的表達(dá)差異可能是導(dǎo)致不同著色模式的重要原因。

圖2 2 個梨品種果皮花色苷合成基因和編碼轉(zhuǎn)錄因子MYB10 基因的熒光定量檢測Fig.2 Relative expression levels of anthocyanin synthesis genes and transcription factor MYB10 genes in the fruit skin of two pear varieties by real-time PCR

3.3 2 個梨品種中MYB10 基因的表達(dá)差異及對花色苷合成的影響

大量研究結(jié)果表明［16］，植物通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控花色苷的生物合成，MYB 家族是與花色苷合成相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，且不同作物涉及的MYB 家族成員不同，例如蘋果有3 個與花色苷合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MdMYB10、MdMYBA、MdMYB1［9］。目前，梨中僅發(fā)現(xiàn)MYB10 轉(zhuǎn)錄因子與梨果實(shí)花色苷合成基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)［5-6，9］，因此，本研究測定了2 個品種果皮中MYB10 基因在不同果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)滿天紅中MYB10 基因表達(dá)量在果實(shí)轉(zhuǎn)色時最高，并與F3GT 的變化趨勢一致。有報(bào)道［16］認(rèn)為，MYBbHLH-WD40 復(fù)合體調(diào)控花色苷合成下游基因的表達(dá)，控制花色苷的合成。比較紅星和滿天紅中MYB10 基因的轉(zhuǎn)錄特性，除了果實(shí)發(fā)育期間變化趨勢不同外，滿天紅中表達(dá)量遠(yuǎn)高于紅星，這種差異是否說明品種間調(diào)控機(jī)制的差異還需深入探討。事實(shí)上，對紅巴梨的研究結(jié)果表明［5］，MYB10 基因的表達(dá)雖與花色苷合成有關(guān)，但MYB10 基因在連鎖群上的定位并未與決定果皮顏色的位點(diǎn)相連鎖，說明西洋紅梨的著色還存在其他決定因素。紅色砂梨尚未有類似的研究報(bào)道。從本研究的結(jié)果看，相對于紅星來說，MYB10 可能對滿天紅的著色更為重要，在滿天紅中MYB10 可能通過調(diào)控F3GT 的表達(dá)調(diào)控滿天紅花色苷的合成。

綜上所述，紅星果實(shí)著色程度可能由多個基因協(xié)同作用，滿天紅著色與否受關(guān)鍵基因F3GT 影響。對于 滿天紅，除光照是著色的調(diào)控因素外，可能還存在其他因素調(diào)控轉(zhuǎn)色。MYB10 可能通過調(diào)控F3GT 的表達(dá)從而調(diào)控滿天紅的著色。

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