SSR 分子標記在糯高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

倪先林， 趙甘霖， 劉天朋， 胡炯凌， 李 元， 陳國民， 汪小楷， 丁國祥

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川 瀘州646000)

高粱起源于非洲，是高光效的C4 作物，具有抗旱、抗?jié)?、耐鹽堿、耐瘠薄等多重抗逆性和適應(yīng)性，是熱帶干旱和半干旱地區(qū)的重要糧食作物和飼料作物，是世界5 大糧食作物之一［1-2］。

根據(jù)籽粒淀粉的性質(zhì)不同，高粱可分為粳型和糯型。糯高粱品種是釀造名優(yōu)白酒的優(yōu)質(zhì)原料，是中國南方名酒的主要原料。近年來，隨著中國酒業(yè)和飼料行業(yè)的發(fā)展，高粱的供需矛盾日益突出，導(dǎo)致目前高粱生產(chǎn)能力不足，這對中國高粱育種工作者們提出了迫切的要求，并使中國的高粱育種向?qū)Ｓ没贩N方向發(fā)展。

種質(zhì)資源遺傳多樣性是育種的基礎(chǔ)。遺傳多樣性的研究對作物種質(zhì)資源的收集、保存、評價和利用均具有十分重要的意義［3］。高粱起源于非州，其基因組較小，比水稻稍大，但遠小于玉米，是禾本科類作物基因組結(jié)構(gòu)、功能和進化研究的又一重要模式作物，并日益受到重視。高粱雜種優(yōu)勢強，是最早實現(xiàn)雜種優(yōu)勢利用的作物之一。育種實踐證明，親本間的遺傳差異是產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的根本原因，親本間的親緣關(guān)系較遠，雜種表現(xiàn)強優(yōu)勢的可能性較大。因此，全面、系統(tǒng)地研究糯高粱種質(zhì)的遺傳多樣性，明確糯高粱資源的親緣關(guān)系和遺傳差異，對于減少親本選配的盲目性及提高育種效率具有重要意義，但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)等研究方法易受環(huán)境和經(jīng)驗影響，分子標記技術(shù)具有標記數(shù)量多、不受時空和經(jīng)驗限制、能顯著提高選擇效率等優(yōu)點，是檢測種質(zhì)資源的有效工具，已被廣泛應(yīng)用于高粱遺傳多樣性研究、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因/QTL定位、核心種質(zhì)篩選、雜種優(yōu)勢的利用等各方面［4-9］。

國內(nèi)外學(xué)者在高粱尤其是甜高粱的遺傳多樣性方面做了大量研究。Ali 等［10］、趙香娜等［11］和馮國郡等［12］分別利用SSR 標記進行了甜高粱遺傳多樣性研究;余傳漲等［13］用自行開發(fā)的SSR 標記對部分甜高粱和籽粒高粱品種進行了遺傳多樣性分析;Fang 等［14］利用ISSR 標記對高粱、雜交高粱、甜高粱、蘇丹草、黑高粱和假高粱6 種不同高粱屬植物進行了遺傳關(guān)系研究;Zhang 等［15］利用SSR 標記，以69 份國外品種為對照，對12 個地區(qū)的184 份中國高粱地方品種進行了遺傳多樣性分析。由于國內(nèi)野生糯高粱資源相對匱乏，分布不均，且大部分為常規(guī)品種，不能充分利用，導(dǎo)致目前少有針對糯高粱方面的分析報道。本研究以從各地收集和自育而來的29 份糯高粱種質(zhì)資源為材料，利用SSR 標記檢測其遺傳多樣性，試圖明確這些糯高粱種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳差異等，從而避免育種實踐中親本選配的盲目性，為雜交糯高粱新品種的選育及雜種優(yōu)勢利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的29 份糯質(zhì)高粱資源包括9 個不育系和20 個恢復(fù)系，分別來自四川、河南、河北、山西、湖南、北京等地市省份，具體材料列于表1。

表1 供試高粱材料Table 1 Sorghum varieties used in this study

1.2 高粱DNA 提取及SSR 分子標記來源

每個材料隨機選取適量種子在培養(yǎng)箱中發(fā)芽培養(yǎng)7 d，剪取幼苗葉片采用CTAB 法提取糯高粱基因組DNA［16］。

根據(jù)網(wǎng)上信息和文獻中已公開發(fā)表的高粱微衛(wèi)星引物序列［13］，選用60 對分布在高粱染色體10 個連鎖群上的SSR 引物對供試材料進行PCR 擴增(http://sorgblast3.tamu. edu/Sorghum Genome/Mapping)，所有SSR 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3 SSR 標記分析

PCR 反應(yīng)體系總體積為20.0 μl，包括10.0 mmol/L dNTP 0.5 μl、10 × Buffer 2.0 μl、25.0 mmol/L MgCl22.0 μl、引物2.0 μl、5 U Taq 酶0.2 μl、模板DNA 2.0 μl、超純水11.3 μl。PCR 擴增程序為94 ℃變性5 min;94 ℃變性50 s，55 ℃(根據(jù)引物Tm 值確定)退火50 s，72 ℃延伸55 s，循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，經(jīng)EB 染色后在Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)下成像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每檢測到1 條多態(tài)性帶視為1 個等位基因，根據(jù)PCR 擴增結(jié)果，在相同遷移位置有帶時記為1，無帶時記為0，缺失記為9。利用NTSYSpc 2.10 軟件中的Qualitative date 計算任意2 個品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)，計算公式為:GS =2Nij/(Ni+Nj)。其中，Nij為材料i 和j 共有的擴增片段總數(shù)，Ni為材料i 中出現(xiàn)的擴增片段數(shù)目，Nj為材料j 中出現(xiàn)的擴增片段數(shù)目。

SSR 位點的多態(tài)性信息含量(Polymorphism index contents，PIC)，PIC =1-Σ(pi)2，式中pi為第i個多態(tài)位點上的基因頻率［17］。有效等位基因位點數(shù)(Effective number of alleles，E)，E =1/Σ(pi)2，式中，pi為第i 個多態(tài)位點上的基因頻率，n 為檢測的位點數(shù)［18］。

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析在EXCEL 2003 和NTSYS-pc2.10［19］系統(tǒng)下進行。根據(jù)所得的遺傳相似系數(shù)，采用算術(shù)平均數(shù)非加權(quán)成組法(UPGMA)進行聚類分析，并繪制樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標記分析

從60 對SSR 引物中篩選出擴增帶清晰且多態(tài)性較好的25 對進行統(tǒng)計分析，結(jié)果(表2)顯示，25對多態(tài)性引物分布于高粱9 個連鎖群上，共檢測到59 個等位基因，其中有效等位基因數(shù)為45.2 個，涉及25 個SSR 位點。平均每個位點檢測到的等位基因數(shù)為2.28 個，變化范圍2 ～4 個，每對引物檢測到的有效等位基因數(shù)平均為1.81 個。大部分引物只檢測出了2 個等位基因，引物Xtxp265 檢測出的等位基因數(shù)最多，為4 個。根據(jù)每個等位基因出現(xiàn)的頻率計算引物位點的多態(tài)信息含量(PIC)，25 個引物的平均多態(tài)信息含量為0.34，變化范圍0.17(Xtxp58)～0.62(Xtxp265)。25 個位點檢測出的等位基因數(shù)與多態(tài)信息含量指數(shù)大小不太一致，但兩者表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系(r =0.571 9＊＊)，說明引物檢測到的等位變異數(shù)越多，其PIC 值就可能越大。3560R 變是3560R 的一個自然黃化突變體，引物Xtxp265 在兩者之間檢測出了差異，能將兩者區(qū)分開來，說明引物Xtxp265 可能與3560R 的黃化突變基因有關(guān)。

2.2 遺傳變異分析

29 份糯高粱種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.20(L402A/3560R 變)～0.95(7R/9R)，平均為0.60(圖1);7R 和9R 之間的遺傳相似系數(shù)最大，說明這兩個種質(zhì)之間的親緣關(guān)系最近，L402A 和3560R 變之間的遺傳相似系數(shù)最小，說明兩者的親緣關(guān)系最遠。不育系之間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.46 ～0.90，平均為0.70;恢復(fù)系之間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.37 ～0.95，平均為0.70。不育系、恢復(fù)系的平均遺傳相似系數(shù)均較大，說明不育系和恢復(fù)系各自群體內(nèi)的親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性較小。不育系和恢復(fù)系之間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.20(L402A/3560R 變)～0.64(18A/瀘恢1)，平均為0.44(表3);不育系18A 與恢復(fù)系之間的平均遺傳相似系數(shù)最大，為0.54，L402A 與恢復(fù)系之間的平均遺傳相似系數(shù)最小，為0.37;恢復(fù)系58R 與不育系之間的平均遺傳相似系數(shù)最大，為0.53，3560R變與不育系之間的平均遺傳相似系數(shù)最小，為0.35。不育系和恢復(fù)系的180 個遺傳相似系數(shù)中，有142 個小于0.50，占78.9%，說明不育系和恢復(fù)系之間的親緣關(guān)系較遠，遺傳多樣性較大。不育系和恢復(fù)系之間的平均遺傳相似系數(shù)比不育系和恢復(fù)系群內(nèi)的小，說明本研究中的遺傳多樣性主要來自于類群間，這有利于強優(yōu)勢雜交糯高粱新組合的配制。

表2 25 對SSR 引物在29 份糯高粱資源中檢測到的等位基因數(shù)目及多態(tài)信息含量Table 2 Allele numbers and PIC values for 25 loci detected in 29 glutinous sorghum accessions

圖1 基于SSR 標記的29 份糯高粱種質(zhì)資源的聚類圖Fig.1 Phylogenetic tree of 29 glutinous sorghum accessions based on SSR data

表3 29 份糯高粱材料之間的遺傳相似系數(shù)Table 3 The genetic similarity coefficients among 29 glutinous sorghum accessions

2.3 聚類分析

利用SSR 標記遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA方法對29 份糯高粱種質(zhì)資源進行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)0.48 處將供試材料明顯地劃分為2 大類(圖1)。45A 等9 個不育系材料聚為一類，屬于不育系類群，除18A 與3246A 之間的遺傳相似系數(shù)較小外，類群內(nèi)其余不育系間的遺傳相似系數(shù)都大于0.50，表明不育系類群的遺傳多樣性較小。瀘恢1等20 個材料聚為第二類，屬于恢復(fù)系類群，類群內(nèi)遺傳相似系數(shù)為0.37 ～0.95，其中遺傳相似系數(shù)大于0.50 的占93.7%，說明恢復(fù)系之間的遺傳多樣性也相對較小。

在遺傳相似系數(shù)0.59 處，不育系類又可分為3個亞類，45A、72A、L402A、L401A、1170A 為第I 亞類。第II 亞類包括3246A、L407A 和3268A 3 個不育系，這3 個材料都來自遼寧，且籽粒均為白色。18A 為第III 亞類，其株高最矮、千粒質(zhì)量小、生育期短，與其他不育系有明顯的不同?；謴?fù)系類也可劃分為3 個亞類，第I 亞類包括瀘恢1 等16 個材料，所有品種的粒色分為橙紅色和紅色兩種;1047R 和11LF23R 的親本之一為10721R，三者聚在一起。3560R 變?yōu)?560R 的一個黃化突變體，兩者之間的親緣關(guān)系較近，聚在一個亞類，但聚類分析表明兩者之間仍存在一定的遺傳差異;第2 亞類包括60R、657-1R、晉57 系、7R、9R、10R 6 個品種，其中，60R來自河南，657-1R 來自北京，晉57 系來自山西，三者的生育期都較短，穗型較緊，其余材料來自遼寧。L101R 與其他恢復(fù)系的平均遺傳相似系數(shù)最小，親緣關(guān)系最遠，為第3 亞類，其生育期最遲、株高較高、千粒質(zhì)量大、籽粒為白色，與其他恢復(fù)系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出明顯的不同。不同地理來源的品種聚在了一起，說明糯高粱品種的親緣關(guān)系與地理來源關(guān)系不大。雖然SSR 標記在本研究中得出的遺傳相似系數(shù)較大，但仍能準確地將本試驗中的材料劃分為2大類，且能將親緣關(guān)系較近的材料區(qū)別開來，說明SSR 標記能有效地應(yīng)用于糯高粱種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定和遺傳多樣性分析中。

3 討論

種質(zhì)資源遺傳多樣性是育種的基礎(chǔ)，通過遺傳多樣性的研究可以從整體上把握該物種的資源，為使用者提供重要信息。以往的學(xué)者常用植物學(xué)性狀來研究高粱的遺傳多樣性，如株高、穗長、生育期、枝梗數(shù)等［20-21］，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，高粱遺傳多樣性的檢測逐漸深入到分子水平。利用分子標記技術(shù)可以從DNA 水平將作物種質(zhì)有效區(qū)分開來，可以更準確地檢測種質(zhì)資源遺傳多樣性，明確系譜不清、來源不明的高粱種質(zhì)的遺傳背景，從而更有針對性地組配親本，提高育種效率，為雜交高粱育種提供理論指導(dǎo)。

Zhang 等［15］利用32 個高粱核基因組多態(tài)性SSR 位點，以69 份國外品種為對照，對12 個地區(qū)的184 份中國高粱地方品種進行了遺傳多樣性分析，比較發(fā)現(xiàn)中國高粱的遺傳多樣性明顯低于國外高粱，中國高粱與國外高粱之間遺傳分化明顯，而中國高粱地方品種地區(qū)間和類型間分化極弱。主成分分析(PCA)能夠明顯區(qū)分中外高粱種質(zhì)但不能將中國高粱按地區(qū)或類型分開。Ali 等［10］用SSR 標記分析了72 個甜高粱材料，得到的聚類結(jié)果與已知的家譜和遺傳背景信息相吻合。趙香娜等［11］用SSR 標記對國內(nèi)外206 份甜高粱種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，得到的遺傳變異關(guān)系與農(nóng)藝性狀反映的遺傳變異關(guān)系不盡一致。徐影等［22］用RAPD 標記和SSR標記分析了20 份甜高粱的遺傳多態(tài)性，2 種分子標記的單獨聚類分析結(jié)果表現(xiàn)出一定差異，但兩種趨勢大致相近，聯(lián)合數(shù)據(jù)分析結(jié)果與單一分子標記結(jié)果揭示的品種親緣關(guān)系趨勢大致相近，但不完全一致，且SSR 標記結(jié)果與聯(lián)合標記結(jié)果更加相近，2 種分子標記聯(lián)合數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果與雜交種系譜親本來源調(diào)查結(jié)果和生物學(xué)特征觀測結(jié)果基本一致。表明SSR 標記在糯高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的有效性。

本研究結(jié)果表明，29 份糯高粱種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.20 ～0.95，平均為0.59，25 個引物的平均多態(tài)信息含量為0.34，不僅具有相同等位位點的引物的多態(tài)信息含量不同，而且多態(tài)信息含量與等位位點數(shù)目不盡一致，表明本研究中所用的29 個糯高粱材料的變異程度較高，遺傳多樣性相對較高。不育系和恢復(fù)系各自群內(nèi)的平均遺傳相似系數(shù)均較大，而不育系和恢復(fù)系之間的平均遺傳相似系數(shù)較小，說明本研究中的遺傳多樣性主要來源于類群間。不育系和恢復(fù)系之間的遺傳相似系數(shù)小，表明2 個類群間的遺傳差異較大，有可利用的性狀優(yōu)勢，這有利于糯高粱新品種的選育和雜種優(yōu)勢利用。

聚類分析將29 份糯高粱種質(zhì)明顯地劃分為不育系和恢復(fù)系兩大類，與其系譜關(guān)系相吻合。大部分聚在1 個亞類的品種在農(nóng)藝性狀上都具有一定的共性和相似性，如恢復(fù)系7R 和9R 之間的遺傳相似系數(shù)為0.95，2 個材料在株高、粒色、生育期等農(nóng)藝性狀上的表現(xiàn)基本一致，差異較小。聚類分析表明，不同地理來源的品種聚在了一起，這可能是由于一些品種長期適應(yīng)不同地域生態(tài)條件的結(jié)果，同時說明親緣關(guān)系與地理來源關(guān)系不大，這與其他研究者的結(jié)果一致［23］。此外，本研究中的部分SSR 標記能將親緣關(guān)系較近的品系區(qū)分開來，如Xtxp265 能將3560R 和3560R 變鑒別開來，表明該SSR 標記能作為核心引物在糯高粱種質(zhì)資源鑒定中應(yīng)用。多態(tài)性信息量(PIC)值反映了某一對SSR 引物對品種的區(qū)分能力，是衡量基因變異程度高低的指標。本研究中25 個引物檢測到的平均多態(tài)信息含量為0.34，相對較低，這可能與所選用的糯高粱種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)，也可能與所選用的SSR 標記有關(guān)，本研究中所選用的引物類型比較單一，主要為Xtxp型，其他類型的引物較少，多態(tài)性引物也主要分布在連鎖群A、F 和H 上，其他連鎖群上的較少。因此，要準確地鑒定親緣關(guān)系較近的親本之間的遺傳關(guān)系，應(yīng)盡可能在覆蓋高粱全基因組的基礎(chǔ)上選擇一些多態(tài)性好、類型豐富的引物，同時盡量增加樣本數(shù)量。

中國的野生糯高粱資源大部分為地方品種，存在株高偏高、抗性較差、產(chǎn)量低等缺點，難以進一步利用。因此，糯高粱種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究對糯高粱種質(zhì)資源的的保護、創(chuàng)新和利用具有重要意義，對糯高粱雜種優(yōu)勢育種具有重要的實踐意義。

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