活化T細(xì)胞核因子調(diào)控基因在鈣調(diào)磷酸酶抑制劑藥效學(xué)監(jiān)測中的研究進(jìn)展

袁梅，閆美玲，張弋（.天津醫(yī)科大學(xué)第一中心臨床學(xué)院，天津 300070；.天津市第一中心醫(yī)院，天津 3009）

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（CNI）包括環(huán)孢素A（CsA）、他克莫司（FK506），廣泛應(yīng)用于器官移植，超過80%的肝移植、腎移植患者使用CNI作為移植術(shù)后的免疫抑制劑［1］。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，CNI具有療效好、急性排斥反應(yīng)發(fā)生率低的特點［2］。然而，CNI治療窗十分狹窄，臨床使用經(jīng)驗劑量很可能會導(dǎo)致感染、癌癥、心血管疾病或由免疫抑制劑劑量過低引起的排斥反應(yīng)的發(fā)生。此外，臨床使用CsA可能會出現(xiàn)腎毒性、多毛癥、牙齦增生、高血壓等不良反應(yīng)；使用FK506可能會出現(xiàn)高血糖和神經(jīng)毒性。大部分不良反應(yīng)的發(fā)生都和藥物劑量有直接的關(guān)系［3-6］。然而血藥濃度水平低于靶濃度時，患者發(fā)生急性排斥反應(yīng)的風(fēng)險就會顯著升高。因此，使用CNI類藥物時必須進(jìn)行常規(guī)的治療藥物監(jiān)測（TDM），才能避免發(fā)生不良反應(yīng)。但是，TDM并不能很好地預(yù)測CNI對人體免疫細(xì)胞的作用，因為它不能反映出CNI對患者免疫系統(tǒng)的個體化抑制作用［7］。不同的患者在相同的血藥濃度下，其體內(nèi)的免疫抑制程度可能會有很大的差異，這是由于不同患者的個體差異造成的對CNI藥效反應(yīng)的不同［8］。因此，我們除了對使用CNI的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測外，還需要監(jiān)測患者體內(nèi)的免疫抑制情況［9-11］，從而對CNI進(jìn)行藥效學(xué)監(jiān)測。最新研究表明，定量分析人體外周血中活化T細(xì)胞核因子（NFAT）調(diào)控基因：白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）的mRNA表達(dá)的均值可以用于CNI的藥效學(xué)監(jiān)測［12-13］。

1 CNI對人體的作用方式與藥效學(xué)監(jiān)測方法

CsA和FK506作用于T淋巴細(xì)胞，其主要作用就是抑制鈣調(diào)磷酸酶的活性。鈣調(diào)磷酸酶是激活T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫所必須的條件，而且它是CsA親環(huán)蛋白和FK506結(jié)合蛋白復(fù)合物的結(jié)合目標(biāo)。抑制鈣調(diào)磷酸酶的活性可以直接下調(diào)NFAT的脫磷酸作用，并隨后阻止轉(zhuǎn)錄因子NFAT進(jìn)入細(xì)胞核脫磷酸化，從而抑制其調(diào)控基因IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表達(dá)，與此同時，一些免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子，例如IL-2或IFN-γ的轉(zhuǎn)錄過程被抑制［14-16］。

目前，已經(jīng)存在一些分析方法可以用于評價CNI的藥效學(xué)作用，并且試驗結(jié)果表明這些藥效學(xué)參數(shù)可以用于免疫抑制劑的藥效學(xué)監(jiān)測［9，11，13］。這些評價指標(biāo)包括檢測鈣調(diào)磷酸酶活性，從而監(jiān)測CNI對人體的免疫抑制情況；檢測人體細(xì)胞因子的表達(dá)情況或T淋巴細(xì)胞增殖情況，從而反映CNI對人體免疫細(xì)胞的抑制程度。然而，這些評價指標(biāo)的檢測，例如人體細(xì)胞因子的合成情況、活性生物標(biāo)志物的表達(dá)情況、T淋巴細(xì)胞的增殖情況或者鈣調(diào)磷酸酶的活性在臨床實際的應(yīng)用意義尚未明確［11，17-18］。Giese 等［19］使用定量分析基因表達(dá)的方法來計算CNI的作用效果，特別是檢測對NFAT調(diào)控基因在外周血中轉(zhuǎn)錄活性的抑制情況。這種實驗方法是基于定量分析IL-2、IFN-γ和粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、集落刺激因子在全血樣本中基因表達(dá)的均值，血樣的收集時間是CsA/FK506低谷時間（T0）和口服藥物兩小時后（T2）。臨床研究表明，定量分析NFAT調(diào)控基因（IL-2、IFN-γ、GM-CSF）mRNA表達(dá)均值的方法可以用于移植術(shù)后病情穩(wěn)定患者的CNI的特定藥效學(xué)監(jiān)測，是一種個體化CNI方案的有效工具［19］。

2 以NFAT調(diào)控基因的表達(dá)水平評價CNI藥效學(xué)

藥效學(xué)監(jiān)測方法只有結(jié)果準(zhǔn)確可靠并易于檢測才能應(yīng)用于臨床的藥效學(xué)監(jiān)測中。如今，定量檢測基因表達(dá)水平的方法已經(jīng)應(yīng)用于日常檢測中。這種分析方法可以提供準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果而且檢測方法方便快捷，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷中，甚至已應(yīng)用于藥效學(xué)監(jiān)測的相關(guān)性研究實驗中，并已確定了一些藥效學(xué)相關(guān)性參數(shù)。實時熒光PCR檢測方法是一種定量分析基因mRNA表達(dá)水平的快捷、高重現(xiàn)性并且高靈敏度的技術(shù)［20］。這種基因表達(dá)水平的檢測方法必須使用組織、外周全血或外周單核細(xì)胞（PBMCs）來進(jìn)行定量分析［21］。

由于CNI通過抑制NFAT轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來發(fā)揮藥效，在初次研究中使用熒光定量PCR方法檢測人體分離的PBMCs來確定其基因表達(dá)的水平［19］。然而，由于分離出來的PBMCs在體外時其對藥物的釋放度會產(chǎn)生一定程度的變化。而檢測服用CsA后人體內(nèi)的全血樣本就可以確定有效的治療藥物劑量［21］。因此，在隨后的臨床研究中我們直接使用全血樣本來進(jìn)行檢測，不再需要分離人體PBMCs。

一項對健康受試者體內(nèi)血細(xì)胞的NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平檢測結(jié)果表明，當(dāng)CsA在全血中的濃度達(dá)到 100 ～ 500 μg/L 時，人體內(nèi)的 IL-2、TNF-γ的mRNA表達(dá)受到抑制［19］。這項研究結(jié)果表明，人體內(nèi)CsA血藥濃度在谷濃度和峰濃度時均對體內(nèi)IL-2、TNF-γ的mRNA表達(dá)有抑制作用。與此同時，對全血中FK506的濃度測定與NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的測定結(jié)果也證實了這一結(jié)論。在一次使用全血樣本來進(jìn)行NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平監(jiān)測的初步研究中，進(jìn)行腎移植和心臟移植的患者術(shù)后使用CNI后，其體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因的表達(dá)水平與健康對照組相比，其表達(dá)值平均減少3倍之多。在大多數(shù)發(fā)表的臨床研究中，NFAT調(diào)控基因的表達(dá)與患者個體化使用CNI的劑量密切相關(guān)［19，22-23］。而在一項對腎移植患者的長期穩(wěn)定的研究中，腎移植患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的表達(dá)水平具有很高的個體化差異，從2%～50%不等［24］。這些數(shù)據(jù)表明，腎移植患者術(shù)后體內(nèi)的免疫抑制劑對免疫系統(tǒng)的作用程度具有相當(dāng)大的個體化差異，應(yīng)該對患者體內(nèi)的免疫功能進(jìn)行個體化的監(jiān)測。因此，我們建議對腎移植術(shù)后患者進(jìn)行常規(guī)CNI藥物動力學(xué)監(jiān)測的同時，也要進(jìn)行NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的監(jiān)測。

3 NFAT調(diào)控基因的表達(dá)在CsA中的臨床應(yīng)用

眾所周知，藥效學(xué)監(jiān)測方法只有證實其對臨床應(yīng)用有益處，這種藥效學(xué)監(jiān)測方法才可行。盡管文獻(xiàn)中報道了多種應(yīng)用于CNI藥效學(xué)監(jiān)測的方法，但目前尚未有一種方法在臨床實踐中實現(xiàn)。而一些臨床研究結(jié)果證實了NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的測定可以作為有效的CNI個體化用藥的藥效學(xué)監(jiān)測方法。

在一項前瞻性臨床觀察研究中，對腎移植術(shù)后5年以上的穩(wěn)定期腎移植患者進(jìn)行NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平測定的結(jié)果表明，應(yīng)用CsA的患者如果其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因即IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表達(dá)值的總體平均值偏低，則患者發(fā)生反復(fù)感染與腫瘤病變的可能性則顯著提高，且患者發(fā)生非黑瘤皮膚癌的風(fēng)險也會顯著提升［25］。在一項對照研究中，逐漸減少患者的CsA劑量，患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)的平均值不斷升高，但并沒有發(fā)生任何不良反應(yīng)。只有一位患者在其CsA劑量不斷減少且體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)平均值升高了40%以后，該患者發(fā)生了急性細(xì)胞排斥反應(yīng)，并且隨著逐漸減少CsA劑量，患者的收縮壓和平均動脈壓均有所下降，從而患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險有所下降［22］。因此，對于腎移植術(shù)后情況長期穩(wěn)定的患者，其體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)平均值維持在20%～30%最佳［26-27］。如果患者體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)平均值低于15%，則患者發(fā)生感染的風(fēng)險顯著升高（57.4%比14.7%，P＜0.001）。邏輯回歸分析的結(jié)果證實，NFAT調(diào)控基因的表達(dá)值是發(fā)生反復(fù)感染的獨立影響因素之一?；颊唧w內(nèi)NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)平均值低于15%時，會增加患者發(fā)生非黑瘤皮膚癌的風(fēng)險，同時也增加發(fā)生CsA不良反應(yīng)的風(fēng)險。NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)平均值維持在15%～30%時，大部分腎移植患者的移植腎功能都是正常且穩(wěn)定的［28］?？偠灾趯﹂L期穩(wěn)定的腎移植術(shù)后患者的前瞻性臨床試驗研究中證實，監(jiān)測NFAT調(diào)控基因的表達(dá)值可以作為腎移植術(shù)后長期穩(wěn)定的患者減少CsA劑量的一項重要的依據(jù)。

在最新的一項臨床研究［29］中，研究者對18例肝移植術(shù)后使用CsA作為免疫抑制劑的兒童患者進(jìn)行了體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的測定。結(jié)果表明，NFAT調(diào)控基因的表達(dá)水平與CsA-C2血藥濃度具有良好的相關(guān)性（r2＝0.647，P＜0.002）。同時，研究者還發(fā)現(xiàn)，在這18例兒童中有6例兒童發(fā)生了感染，而這6例兒童體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平較未發(fā)生感染反應(yīng)的兒童顯著偏低（27%比50%，P＝0.041）。

Steinebrunner等［30］在一項對肝移植術(shù)后發(fā)生巨細(xì)胞病毒（CMV）感染的患者與術(shù)后情況穩(wěn)定的患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)水平的研究中發(fā)現(xiàn)，10例術(shù)后使用CsA作為免疫抑制劑且發(fā)生了CMV感染的患者與20例術(shù)后使用CsA作為免疫抑制劑且情況穩(wěn)定的患者相比，其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)水平偏低（30±17比44±20，P＝0.067），體內(nèi)IFN-γ的表達(dá)值則顯著偏低（26±17比43±17，P＝0.0125）。而兩組患者服用的CsA劑量和C0、C2的血藥濃度并無顯著差異（CsA 劑 量 169 mg/d比 165 mg/d，C0 CsA 94 μg/L比 85 μg/L，C2 CsA 389 μg/L 比 381 μg/L；P ＞ 0.05）。而Steinebrunner等［31］在另一項對肝移植患者術(shù)后早期的前瞻性試驗研究中發(fā)現(xiàn)，13例術(shù)后應(yīng)用CsA作為免疫抑制劑的肝移植患者，其體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)水平在術(shù)后顯著提高，4～7個月與術(shù)后1個月時相比為（25±7） μg/L比（9±5） μg/L（P ≤ 0.000 1）。

迄今，這些試驗研究對患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的測定都開始于腎移植術(shù)后早期。正如預(yù)測的那樣，對這些腎移植術(shù)后早期患者的觀察表明，對于大部分腎移植患者而言，高劑量CsA對患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的表達(dá)有顯著的抑制作用［32］。相應(yīng)的，如果減少CsA劑量，其體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因的表達(dá)水平會明顯上升。然而，相比較正常患者而言，腎移植術(shù)后早期發(fā)生感染的患者，其體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平顯著偏低。如果減少CsA劑量，則相應(yīng)減少了對人體NFAT調(diào)控基因的表達(dá)抑制，但一部分患者則會出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)。然而，我們應(yīng)該注意到，還有少部分腎移植患者，其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的表達(dá)水平是相同的，但患者卻分別出現(xiàn)了急性排斥反應(yīng)和感染兩種截然相反的不良反應(yīng)?？偠灾壳芭R床上報道的關(guān)于腎移植術(shù)后早期CNI藥效學(xué)的試驗數(shù)據(jù)還很少，并且由于腎移植術(shù)后早期臨床給予患者高劑量的CNI，使得評價患者體內(nèi)CNI藥效學(xué)與NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平之間的關(guān)系還是有一定的困難。

4 NFAT調(diào)控基因的表達(dá)在FK506中的臨床應(yīng)用

目前，最實用的且對臨床有實際應(yīng)用價值的FK506藥效學(xué)監(jiān)測方法就是檢測NFAT調(diào)控基因IL-2、IFN-γ、GM-CSF的mRNA表達(dá)水平，這種檢測方法的實際意義已經(jīng)在對穩(wěn)定期的腎移植患者進(jìn)行藥效學(xué)監(jiān)測中得到證實［33］?；颊呖诜﨔K506 1.5小時后，其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的最小中位數(shù)相差很大，從0%到138%不等。在對262例腎移植術(shù)后穩(wěn)定期患者的研究中發(fā)現(xiàn)，超過半數(shù)患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平低于30%，而有25例患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平高于80%。發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者與正?；颊呦啾?，在FK506谷濃度相同的條件下，發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平明顯偏高。有25%的患者在體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平高于30%時都發(fā)生了急性排斥反應(yīng)。然而有20例患者，在其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因沒有表達(dá)或受到少量抑制時，并無任何排斥反應(yīng)出現(xiàn)。

與上述研究相似的研究試驗結(jié)果表明，在發(fā)生感染的穩(wěn)定期腎移植患者中，其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的中位數(shù)是12%，與正?；颊叩?2%相比，顯著降低。其中7例患者出現(xiàn)了惡性腫瘤：3例患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平低于30%，而其他4例患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平超過30%［34］。此外，體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平抑制程度低的患者與抑制程度高的患者相比，具有更好的移植腎功能。多元回歸分析結(jié)果表明，患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的中位數(shù)是急性排斥反應(yīng)的一個獨立影響因素；而感染則與患者的性別和體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平密切相關(guān)。

在一項較小的前瞻性試驗研究中，感染CMV的患者服用FK506 1.5小時后其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平較未感染CMV的患者顯著下降（13%比26%，P＜0.05）［34］。邏輯回歸分析的結(jié)果表明，服用FK506 1.5小時后患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平與感染CMV的風(fēng)險密切相關(guān)。

一項對由使用CsA轉(zhuǎn)換為使用FK506的移植患者的初步研究結(jié)果表明，患者使用FK506后體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平會比服用CsA增高7倍之多［33］。對27例由于臨床情況的原因由CsA轉(zhuǎn)服FK506的患者的研究結(jié)果顯示，患者服用CsA時體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的中位數(shù)是3.0%，而轉(zhuǎn)服FK506后，患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的中位數(shù)是 36.5%［35-36］。Fukudo等［37］的研究結(jié)果表明，患者服用FK506后當(dāng)血藥濃度達(dá)峰值時其值高于20 μg/L，而患者服用CsA后其血藥濃度超過700 μg/L時，患者體內(nèi)鈣調(diào)磷酸酶的活性被完全抑制［38］。

在一項對肝移植術(shù)后發(fā)生CMV感染的患者與術(shù)后情況穩(wěn)定的患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因總體表達(dá)水平的研究中，Steinebrunner等［30］發(fā)現(xiàn)，10例術(shù)后使用FK506作為免疫抑制劑且發(fā)生了巨細(xì)胞病毒感染的患者與20例術(shù)后使用FK506作為免疫抑制劑且情況穩(wěn)定的患者相比，其體內(nèi)NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)水平偏低（68±25比84±22，P＝0.076 9），IFN-γ表達(dá)值也顯著偏低（61±24比88±29，P＝0.015 4）。而兩組患者服用的FK506劑量和C1.5的血藥濃度則并無顯著差異（FK506劑量4 mg/d 比 4 mg/d ；FK506 C1.5 8 μg/L 比 10 μg/L）。而Steinebrunner等［31］在另一項對肝移植患者術(shù)后早期的前瞻性試驗研究中發(fā)現(xiàn)，9例術(shù)后應(yīng)用FK506作為免疫抑制劑的肝移植患者，其體內(nèi)的NFAT調(diào)控基因的總體表達(dá)水平在術(shù)后8～12個月與術(shù)后1個月時相比顯著升高〔（50±8） μg/L比（10±7） μg/L，P ＝ 0.002）〕。

Sommerer等［39］對262例腎移植術(shù)后服用FK506且處于長期穩(wěn)定的患者進(jìn)行了臨床試驗研究，結(jié)果表明，發(fā)生排斥反應(yīng)的患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生排斥反應(yīng)者（57%比21%，P＜0.001）；且發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者體內(nèi)的FK506血藥濃度顯著低于未發(fā)生排斥反應(yīng)者（10 μg/L比18 μg/L，P＜0.001）。發(fā)生感染的患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平顯著低于未發(fā)生感染者（12%比32%，P＜0.001）；且發(fā)生感染的患者體內(nèi)FK506血藥濃度顯著高于未發(fā)生感染反應(yīng)者（22 μg/L比16 μg/L，P ＜ 0.001）。

5 小 結(jié)

一些橫斷面研究和臨床觀察性試驗研究的結(jié)果表明，測定NFAT調(diào)控基因（IL-2、IFN-γ、GM-CSF）的mRNA表達(dá)水平，可以作為一種個體化檢測CsA和FK506免疫抑制劑的工具。定量分析NFAT調(diào)控基因mRNA表達(dá)水平可以為檢測實體器官移植患者體內(nèi)靶細(xì)胞水平的免疫抑制功能提供一種可靠的量化指標(biāo)［40］。尤其是對監(jiān)測患者的不良反應(yīng)，如感染、惡性腫瘤或排斥反應(yīng)都有很大的益處。目前已經(jīng)建立了標(biāo)準(zhǔn)化測定方法，可以使NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的檢測應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測中。使用NFAT調(diào)控基因表達(dá)水平的測定可以在一天內(nèi)檢測出患者體內(nèi)對CNI的藥效學(xué)反應(yīng)。將這種檢測方法與常規(guī)的血藥濃度檢測相結(jié)合，可以個體化患者的CNI劑量。到目前為止，大量臨床試驗表明，移植術(shù)后早期患者體內(nèi)NFAT調(diào)控基因mRNA表達(dá)水平與發(fā)生急性排斥反應(yīng)之間存在著明確的相關(guān)性［41］。然而，有一些重要的問題尚未明確，例如患者在發(fā)生急性感染或慢性感染時是如何影響體內(nèi)NFAT調(diào)控基因mRNA表達(dá)水平的。目前看來，檢測NFAT調(diào)控基因mRNA表達(dá)水平是一種方便快捷且十分可靠的CNI藥效學(xué)檢測工具。

然而，這種檢測技術(shù)本身也有一些局限性。首先，就這種檢測方法目前的使用情況來看，它只能作為一種特定的CNI藥效學(xué)監(jiān)測工具。其次，患者在發(fā)生急性感染或慢性感染時影響體內(nèi)NFAT調(diào)控基因mRNA表達(dá)水平的機(jī)制也尚未明確，且就目前的臨床試驗研究來看，研究對象都是移植術(shù)后長期穩(wěn)定的患者，具有一定的局限性。再次，這種試驗方法尚未在更大、更系統(tǒng)的試驗研究或是前瞻性隨機(jī)臨床試驗研究中得以證實。

總而言之，NFAT調(diào)控基因（IL-2、IFN-γ、GM-CSF）mRNA表達(dá)水平的檢測是一種可以用來監(jiān)測CNI藥效學(xué)的檢測工具，它可以用來評價個體化CNI的臨床給藥劑量。然而，尚有一些問題有待于解決，我們還需要進(jìn)行系統(tǒng)的臨床試驗研究來證實這一檢測方法的可行性。