塞來昔布衍生物抑制劑CIH01對A549肺癌增殖及血管生成影響的實(shí)驗(yàn)研究

李宏軼喻斌

（1江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司 南京210046；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇南京210046）

塞來昔布衍生物抑制劑CIH01對A549肺癌增殖及血管生成影響的實(shí)驗(yàn)研究

李宏軼1喻斌2

（1江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司 南京210046；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇南京210046）

目的：探討選擇性環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑塞來昔布衍生物CIH01對A549肺癌移植瘤的抑制作用及其對肺瘤組織血管生成的影響。方法：建立裸鼠肺癌細(xì)胞株A549移植瘤模型，連續(xù)治療20 d，于末次給藥24 h后處死動物。每周測量2次腫瘤體積及動物體重，以末次各組瘤體積計算抑瘤率。采用Mtrigel Plug實(shí)驗(yàn)方法，連續(xù)治療7 d后取出皮下膠塊，進(jìn)行HE染色，計算各組血管數(shù)平均值。結(jié)果：完成全部治療后，CIH01組的平均腫瘤體積為（216±25）mm3，塞來昔布組的平均腫瘤體積（391±40）mm3，對照組的平均腫瘤體積為（633±92）mm3。CIH01的抑瘤率為64%，明顯優(yōu)于塞來昔布組，P＜0.05。各組Matrigel內(nèi)的平均血管數(shù)分別為（2.82±0.71）、（7.90±2.83）、（10.75±3.11），與塞來昔布組及對照組比較，CIH01組的平均血管數(shù)均顯著減少，P＜0.01。結(jié)論：CIH01對A549移植瘤模型有明顯抑制作用，其作用機(jī)制之一與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。

CIH01；A549模型；環(huán)氧合酶-2；基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)；血管生成

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX），又稱前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶（PGHS），是前列腺素（PGs）合成過程中一個主要的限速酶，可將花生四烯酸（AA）代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而參與機(jī)體的多種病理生理過程，如炎癥、發(fā)熱、出凝血機(jī)制等。近年來研究顯示，環(huán)氧化酶-2（COX-2）與肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，COX-2抑制劑對肺癌可能具有防治作用[1]。選擇性環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑塞來昔布是近年來開發(fā)的新型非甾體類抗炎藥（NSAID），其藥理特點(diǎn)是選擇性作用于COX-2，對COX-1的活性幾乎無抑制作用，表現(xiàn)出良好的腸道安全性。本實(shí)驗(yàn)室合成的COX-2選擇性抑制劑CIH01，為塞來昔布的衍生物。本實(shí)驗(yàn)通過觀察其在裸鼠體內(nèi)對A549肺癌移植瘤的抑制作用，探討其

可能的作用機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株A549（購自美國ATCC細(xì)胞庫）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Balb/c裸鼠45只，雌性，6周齡，體重18～22 g，購自南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心。1.3 主要試劑 RPMI-1640完全培養(yǎng)基（購自Gibco公司），含10%滅活血清，塞來昔布（國藥準(zhǔn)字J20080058）。BD Matrigel（CatNo：356237，購自上海偉進(jìn)生物科技有限公司），Invitrogen bFGF（貨號：13256029，購自上海浩然生物技術(shù)有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)[2]將A549細(xì)胞體外單層培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、含5%

CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周2次用胰酶-EDTA進(jìn)行消化處理傳代。當(dāng)細(xì)胞呈指數(shù)生長期時，收取細(xì)胞，計數(shù)。將5×106A549腫瘤細(xì)胞懸浮于0.15 ml PBS，接種于每只裸鼠的右上側(cè)軀干。當(dāng)觀察到有明顯瘤塊形成后，開始用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5 a×b2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。腫瘤平均體積達(dá)到120 mm3時，挑選24只腫瘤生長狀態(tài)較好的荷瘤鼠分為三組。治療組給予60 mg/kg CIH01口服，陽性對照組給予相同劑量塞來昔布，空白對照組給予等體積溶媒。連續(xù)口服給藥20 d后，于24 h后CO2麻醉處死動物。根據(jù)末次腫瘤體積計算抑瘤率，抑瘤率（%）= [1-（實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積/對照組平均瘤體積）]× 100%。

2.2 基質(zhì)膠栓（Matrigel Plug）實(shí)驗(yàn)[3]12只裸鼠腹股溝皮下分別接種0.5 ml BD Matrilgel（無酚紅）與400 ng bFGF混合物后，口服給藥，連續(xù)7 d，于第8天處死動物，取出皮下膠塊，4%多聚甲醛固定，HE染色后（紅色為新生血管，藍(lán)色為基質(zhì)膠），鏡下數(shù)4個視野內(nèi)的血管數(shù)量，計算平均值。

2.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0進(jìn)行所有數(shù)據(jù)分析。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部以（Mean±SEM）表示，用One-way ANOVA進(jìn)行組間比較。如果F值有顯著性差異，在ANOVA分析之后用LSD法再進(jìn)行多重比較。P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 CIH01對腫瘤體積的影響 裸鼠接種A549細(xì)胞1周后可見有皮下移植瘤出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過程中動物未出現(xiàn)明顯的精神、飲食及排便異常。完成全部治療后，CIH01組的平均腫瘤體積為（216±25）mm3，塞來昔布組的平均腫瘤體積（391±40）mm3，對照組的平均腫瘤體積為（633±92）mm3。見圖1。

3.2 各治療組膠栓內(nèi)平均血管數(shù)的變化 HE染色結(jié)果顯示，塞來昔布和CIH01兩者給藥7 d后，都可不同程度降低皮下接種膠栓內(nèi)的平均血管數(shù)。塞來昔布組的平均血管數(shù)為（7.90±2.83），較對照組（10.75±3.11）明顯更低，P＜0.05。CIH01拮抗腫瘤新生血管的作用較塞來昔布更為顯著，平均血管數(shù)僅為（2.82±0.71），與對照組相比有極顯著差異，P＜0.01。見圖2。

4 討論

環(huán)氧化酶參與機(jī)體的多種病理生理過程，如炎癥、發(fā)熱、出凝血機(jī)制等是已經(jīng)公認(rèn)的事實(shí)。近幾年來，國外諸多研究表明，COX-2除了在上述炎癥等過程中發(fā)揮重要作用外，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已經(jīng)成為腫瘤防治的一個新靶點(diǎn)。COX-2促進(jìn)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制主要涉及促進(jìn)腫瘤新生血管的生成[4]、刺激腫瘤細(xì)胞的增殖[5]、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[6]及促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[7]等多種機(jī)制。很多證據(jù)表明，COX-2的高表達(dá)與胃腸癌、肝癌、乳癌、胰腺癌等多種腫瘤關(guān)系密切[8～9]，并且在非小細(xì)胞肺癌尤其腺癌中亦呈現(xiàn)陽性表達(dá)[10]，且COX-2高表達(dá)者的肺癌細(xì)胞具有更高的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向，且預(yù)后不良[11]。本實(shí)驗(yàn)選擇已知COX-2高表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為研究對象，對新一代非甾體類抗炎藥選擇性COX-2抑制劑塞來昔布的新型衍生物CIH01的體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行評價，并同時用塞來昔布進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶媒對照組的腫瘤體積在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時達(dá)到了633 mm3，CIH01在60 mg/kg劑量下，連續(xù)給藥20 d，表現(xiàn)出顯著的抑瘤作用，平均瘤體積為216 mm3（P＜0.01），TGI值為64%。其作用明顯好于相同劑量的塞來昔布（腫瘤體積為391 mm3，TGI=38%），兩組間比較有顯著性差異（P＜0.05）。

腫瘤組織新生血管形成在腫瘤的生長、浸注和轉(zhuǎn)移過程中起著極其重要的作用，腫瘤血管的生成與許多促血管生成因子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，bFGF是其中一種重要的血管生成促進(jìn)因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COX-2抑制劑塞來昔布及其衍生物CIH01都具有明顯的抗腫瘤新生血管生成的作用。與塞來昔布比較，其衍生物具有更為明顯的抗血管生成活性（P＜0.05），兩者的平均血管數(shù)分別為（7.90±2.83）和（2.82±0.71）。該結(jié)果與A549腫瘤模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。由此我們也認(rèn)為，抗腫瘤血管生成作用是塞來昔布及CIH01等COX-2抑制劑抗腫瘤的一個重要機(jī)制。 盡管COX-2抑制劑塞來昔布的抗腫瘤機(jī)制尚未完全闡明，但我們的研究從體內(nèi)試驗(yàn)揭示了塞來昔布及其衍生物CIH01對肺癌有抗腫瘤效應(yīng)。鑒于塞來昔布用于治療肺癌已經(jīng)有多個臨床實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行，因此，我們相信抗腫瘤活性更強(qiáng)且毒性較低的衍生物CIH01在抗腫瘤方面，將具有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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Experimental Study on the Effect of Celecoxib Derivatives Inhibitor CIH01 on the Proliferation of A549 Lung Cancer and the Angiogenesis

LI Hong-yi1,YU Bin2
(1Jiangsu Kangyuan Yangguang Pharmaceutical co,LTD.Nanjing210046;
2College of pharmacy,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu210046)

Objective:To evaluate the effects of celecoxib derivatives CIH01,the cyclooxygenase-2(COX-2)selective inhibitor,on inhibiting A549 lung cancer xenograft and tumor angiogenesis.Methods:Established the tumor homograft model of lung cancer cell line A549 in nude mice,after 20 days treatment,the mice were sacrificed 24 hours after the last administration.Tumor volume and body weight were measured twice weekly and calculated tumor growth inhibition (TGI)using the last measurement.Then used Mtrigel plug assay,subcutaneous rubber blocks of all mice were removed and dyed by HE after 7 days treatment,calculated the number of vessels. Results:After the treatment,the average tumor volume of CIH01 group was(216±25)mm3,the mean tumor volume of celecoxib group was(391±40)mm3,and the mean tumor volume of control group was(633±92)mm3.The inhibition rate of CIH01 group(64%)was significantly higher than that of celecoxib group,P＜0.05.And the average number of vessels of each group was(2.82±0.71),(7.90± 2.83),and(10.75±3.11),the average number of vessels of celecoxib group reduced significantly than the celecoxib group and the control group,P＜0.01.Conclusion:CIH01 has significant inhibitory effect on A549 tumor model,the mechanism of action is related to the inhibition of tumor angiogenesis.

Celecoxib;A549 xenograft model;COX-2;Matrigel plug assay;Angiogenesis

R734.42

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.06.001