試論臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展

王金良

臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了百余年的歷程，該領(lǐng)域吸取了自然科學(xué)研究的成果，經(jīng)過無數(shù)前人的創(chuàng)新及努力，在防治傳統(tǒng)和新興傳染病方面取得了極大的成就［1］。現(xiàn)今，筆者回顧其創(chuàng)新發(fā)展歷程，正視我國臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)存在的不足，因此，加強(qiáng)創(chuàng)新意識、增強(qiáng)創(chuàng)新能力，對促進(jìn)我國臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，奮力趕超國際先進(jìn)水平有著重大的意義。

1 臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)變革的動(dòng)力——?jiǎng)?chuàng)新發(fā)展

回顧臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展歷程，大體上經(jīng)歷了以下4個(gè)發(fā)展階段。

1.1 傳統(tǒng)微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展階段 依靠顯微鏡和染色技術(shù)發(fā)展起來的形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)和傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展起來的細(xì)菌鑒定技術(shù)日臻完善。該技術(shù)自患者的各類標(biāo)本中分離培養(yǎng)病原菌，依據(jù)細(xì)菌的形態(tài)和染色特征、菌落形態(tài)、生化反應(yīng)、菌體抗原結(jié)構(gòu)形成一系列的分離培養(yǎng)和鑒定手段，構(gòu)成了經(jīng)典的細(xì)菌檢驗(yàn)診斷學(xué)。此階段的病毒檢驗(yàn)技術(shù)還未普及，支原體、衣原體、螺旋體、立克次體的檢驗(yàn)技術(shù)尚在起步階段。

1.2 診斷微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展階段 臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在此階段出現(xiàn)了成套鑒定裝置（數(shù)碼鑒定）和半自動(dòng)微生物鑒定技術(shù)，使微生物鑒定系統(tǒng)化。隨后發(fā)展起來的多種自動(dòng)化的微生物鑒定和藥敏分析儀，其基本原理仍是依據(jù)微生物的生長和生化反應(yīng)，只是檢測微生物的酶反應(yīng)底物不斷改進(jìn)，提高了鑒定的可靠性，且使鑒定所需時(shí)間有所減少。此階段大量吸收了免疫學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，包括傳統(tǒng)免疫技術(shù)、標(biāo)記免疫分析技術(shù)（放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫等），形成了診斷微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。

1.3 分子微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展階段 上述兩個(gè)階段所用的技術(shù)是依據(jù)微生物的表型特征，而分子結(jié)構(gòu)是其內(nèi)在本質(zhì)特征。分子微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)所依據(jù)的正是微生物的分子結(jié)構(gòu)和特征。創(chuàng)新的分子生物學(xué)技術(shù)的興起，使微生物的分離、鑒定、新病原體的發(fā)現(xiàn)、微生物致病因素和耐藥機(jī)理的研究、菌株的分型和流行病學(xué)等均發(fā)展到分子水平。

1.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 技術(shù)應(yīng)用于微生物的快速鑒定與分型的代表性技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)。在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上又發(fā)展了恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)、多重PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析等，使臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)入快速發(fā)展的新階段。

1.3.2 質(zhì)譜技術(shù) 與質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合的分子生物學(xué)技術(shù)是近年來臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的一大進(jìn)展。采用質(zhì)譜技術(shù)分析微生物成分已應(yīng)用于微生物的鑒定及分型，還可用于耐藥基因和致病機(jī)理的檢測等?；镜臋z測方式是通過對微生物培養(yǎng)物采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測脂肪酸、多糖組分等進(jìn)行鑒定。最引人注目的進(jìn)展是采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對微生物的組成分子進(jìn)行鑒定。所用的儀器和分析鑒定軟件已在國內(nèi)外應(yīng)用和推廣，有望成為最重要和可靠的微生物鑒定手段。其他常用的質(zhì)譜技術(shù)還有采用變性高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌分型和細(xì)菌耐藥酶的鑒定與分型，和采用血清蛋白質(zhì)組分析技術(shù)來鑒定一些難以培養(yǎng)成功的新型病原體（如Whipple病的病原體）。另外，正在發(fā)展中的還有二維液相色譜血清蛋白質(zhì)組分析技術(shù)。

分子流行病學(xué)技術(shù)是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的又一項(xiàng)新技術(shù)，該技術(shù)用來確定感染的流行菌（毒）株和醫(yī)院感染的流行菌（毒）株。常用的技術(shù)有PCR－限制性片段長度多態(tài)性分析、PCR－單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、PCR－隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析、基因重復(fù)序列的PCR分析、PCR－線性探針分析、多位點(diǎn)序列分型和質(zhì)粒DNA酶切指紋圖譜分析。

1.4 基因微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展階段 由于微生物的一切性狀都是由其基因決定的，因此，基因診斷技術(shù)就更加體現(xiàn)了微生物的本質(zhì)特征?；蛟\斷技術(shù)已徹底改變并將繼續(xù)改變著臨床微生物學(xué)和微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的面貌［2］。微生物基因測序技術(shù)是鑒別微生物的決定性方法，但因儀器昂貴、技術(shù)相對復(fù)雜而不能常規(guī)應(yīng)用。目前，基因和核苷酸多態(tài)性的測序技術(shù)幾經(jīng)改進(jìn)，發(fā)展迅速，多種新型自動(dòng)基因測序儀相繼出現(xiàn)。許多微生物的全部基因序列已經(jīng)確定。新一代的全基因組測序儀可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成基因測序，現(xiàn)用于微生物學(xué)檢驗(yàn)的基因測序技術(shù)有微生物的16SrRNA基因序列分析（16SrRNA是公認(rèn)的原核生物分類鑒定的標(biāo)準(zhǔn)）、18SrRNA基因序列分析（適用于真菌的鑒定分型）、焦磷酸測序和核苷酸多態(tài)性測序等。另外，基因芯片（DNA微陣列）和液相芯片技術(shù)、研究微生物群體的宏基因組學(xué)以及擴(kuò)增血漿游離DNA技術(shù)、納米生物技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等應(yīng)運(yùn)而生［3］。

上述臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展歷程說明，不斷地創(chuàng)新是促進(jìn)其發(fā)展的強(qiáng)大動(dòng)力。通過不斷創(chuàng)新才有了今天的臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。

2 我國臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)滯后的關(guān)鍵在于創(chuàng)新力不足

筆者從事臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)工作已60余年，親歷了其發(fā)展的各階段。最初接觸到的就是國外創(chuàng)建的技術(shù)和名詞，如革蘭氏染色、大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、瓦氏反應(yīng)、康氏反應(yīng)等。檢驗(yàn)操作要嚴(yán)守國外制定的操作規(guī)程，認(rèn)為不越雷池一步是最好的職業(yè)操守。卻也因此逐步形成了思想僵化，不愿變革的習(xí)慣，但內(nèi)心里還是有強(qiáng)烈的改變現(xiàn)狀的愿望，希望能有我國自己的技術(shù)并能得到國外的認(rèn)可，在世界上占有一席之地。筆者也曾努力鉆研技術(shù)，注意總結(jié)自己的心得體會，60多年的工作實(shí)踐，盡管不吝付出，積極向上，也寫過不少文章，參與編寫過幾冊著作，但自問有什么創(chuàng)新技術(shù)問世嗎？茫然！

筆者的個(gè)人經(jīng)歷也許就是國內(nèi)大多數(shù)從業(yè)者的縮影。我國臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)依然滯后，且不論在貧困和欠發(fā)達(dá)地區(qū)尚不能運(yùn)用新技術(shù)，即使是在大的綜合醫(yī)療機(jī)構(gòu)或疾病控制機(jī)構(gòu)也以運(yùn)用國外的儀器和方法為主，就檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)整體來講也是如此。在我國醫(yī)學(xué)專業(yè)中，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的科研課題立項(xiàng)和專利申請量都是較低的。創(chuàng)新意識不足、創(chuàng)新教育缺位、創(chuàng)新能力低下，成為我國臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)甚至檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)技術(shù)滯后的關(guān)鍵問題。

3 抓住機(jī)遇，大力促進(jìn)臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展

當(dāng)前黨中央倡導(dǎo)“萬眾創(chuàng)業(yè)、大眾創(chuàng)新”，這正是技術(shù)創(chuàng)新的大好時(shí)期。我們要抓住機(jī)遇趁勢而上，大力創(chuàng)新技術(shù)。怎樣實(shí)現(xiàn)技術(shù)創(chuàng)新呢？管見所及，提出5個(gè)方面的建議供同行參考。

3.1 培養(yǎng)、樹立和增強(qiáng)創(chuàng)新意識 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作者作為從事技術(shù)工作的人員，工作的要?jiǎng)?wù)在于技術(shù)創(chuàng)新。創(chuàng)新是在充分運(yùn)用和掌握前人技術(shù)成果的基礎(chǔ)上，不斷有所發(fā)現(xiàn)、有所創(chuàng)新和創(chuàng)造，但這不是無科學(xué)依據(jù)的異想天開。創(chuàng)新要不斷鉆研本領(lǐng)域的先進(jìn)理論，依據(jù)科學(xué)規(guī)律來改革。關(guān)鍵在于要有強(qiáng)烈的、正確的創(chuàng)新意識，善于發(fā)現(xiàn)、總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的不足并進(jìn)行改善。創(chuàng)新絕非一蹴而就，要培養(yǎng)和積累創(chuàng)新能力，要從大處著眼、小處著手，才能積小革新為大創(chuàng)新。

3.2 臨床微生物檢驗(yàn)科（室）是技術(shù)創(chuàng)新的主陣地 科學(xué)研究一向以實(shí)驗(yàn)室為主要基地，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的創(chuàng)新歷來帶動(dòng)著科學(xué)的進(jìn)步，不斷推動(dòng)著科學(xué)的發(fā)展。事實(shí)上，我國在臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)方面的成就也是依靠實(shí)驗(yàn)室完成的。如在建國初期，中科院微生物研究所和北京同仁醫(yī)院的湯飛凡教授用雞胚培養(yǎng)技術(shù)首先發(fā)現(xiàn)了沙眼病毒（后被證實(shí)為沙眼衣原體），并在國際上獲獎(jiǎng)。而固守已有觀念，缺乏創(chuàng)新意識，可能貽誤重大發(fā)現(xiàn)的良機(jī)。如上世紀(jì)70至80年代，我國胃病專家在電子顯微鏡下自患者腸黏膜中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌，同時(shí)北京的專家發(fā)現(xiàn)口服呋喃唑酮（痢特靈）治療消化道潰瘍有確定的療效?？上У氖?，由于確信胃酸過多是胃潰瘍的病因，且認(rèn)為在高胃酸環(huán)境下細(xì)菌無法存活，而忽視了實(shí)驗(yàn)室的發(fā)現(xiàn)和臨床證據(jù)，痛失了發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌的機(jī)會［4］。后來，澳大利亞的Warren和Marshall證實(shí)了幽門螺桿菌的存在，且自服幽門螺桿菌菌液證實(shí)其致病性。此項(xiàng)成就在2005年獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。如此深刻的教訓(xùn)提醒我們必須重視實(shí)驗(yàn)室的發(fā)現(xiàn)，依據(jù)線索深究根源，不能固守已有觀念。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)工作者處在臨床檢驗(yàn)一線，每天接觸眾多的臨床標(biāo)本和數(shù)據(jù)，有很多機(jī)會可以有新發(fā)現(xiàn)。然而如果我們?nèi)狈Πl(fā)現(xiàn)問題、解決問題的自覺性，缺乏創(chuàng)新意識，就會錯(cuò)失許多創(chuàng)新機(jī)會。

令人高興的是，近些年國內(nèi)不乏創(chuàng)新成果出現(xiàn)。如重癥急性呼吸綜合征在我國局部地區(qū)的流行極大推動(dòng)了對新病原體和再現(xiàn)病原體檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，對流感病毒H7N9、H5N1等的檢測技術(shù)，自臨床標(biāo)本、環(huán)境、水中檢測軍團(tuán)菌的系列技術(shù)，對細(xì)菌鞭毛染色技術(shù)等的創(chuàng)新［5，6］，都說明微生物實(shí)驗(yàn)室可大有作為。

3.3 從實(shí)際出發(fā)，從發(fā)展適宜技術(shù)入手 創(chuàng)新要從實(shí)際出發(fā)，從切實(shí)可行的條件出發(fā)，不能好高騖遠(yuǎn)，不能浮躁取巧。必須承認(rèn)，臨床實(shí)驗(yàn)室的條件確實(shí)不如科研機(jī)構(gòu)，技術(shù)創(chuàng)新有一定難度，但是任何創(chuàng)新都會遇到困難，任何改進(jìn)都要付出艱辛努力。條件固然是重要的，但在有心人面前，條件又是可以創(chuàng)造的。目前國內(nèi)大多數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)室還不具備質(zhì)譜、分子和基因檢測的技術(shù)手段。有，當(dāng)然好；沒有，也不等于不能做好檢驗(yàn)工作和技術(shù)創(chuàng)新。筆者贊同發(fā)展和提倡適宜技術(shù)，即適合國情和適合自己條件的技術(shù)，如微生物檢驗(yàn)傳統(tǒng)技術(shù)中的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)菌形態(tài)學(xué)和菌落形態(tài)學(xué)技術(shù)仍是檢驗(yàn)的基本功，大有發(fā)展余地。陳東科、孫長貴和周庭銀教授主編的微生物圖譜具有中國特色，為推廣此類技術(shù)做出重要貢獻(xiàn)［7，8］。試想，如果依據(jù)細(xì)菌和菌落的典型形態(tài)和色素生成就能鑒定出銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌，何需再用復(fù)雜而昂貴的分子和基因診斷技術(shù)呢？適宜技術(shù)絕不排斥分子、基因診斷技術(shù)，關(guān)鍵在于如何用得恰到好處。

現(xiàn)在國外也在重視建立簡捷微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室［9］，其目的是使診斷流程便捷、增效、節(jié)約，即精簡人員和檢驗(yàn)流程，充分利用信息技術(shù)，用簡便、實(shí)用的技術(shù)解決微生物診斷中的問題。其作用與核心實(shí)驗(yàn)室相輔相成。

3.4 發(fā)揮團(tuán)隊(duì)精神，聯(lián)合一切可用的力量 在先進(jìn)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，創(chuàng)新已不能靠單打獨(dú)斗完成，科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)是創(chuàng)新中攻堅(jiān)克難的最佳組織形式。我們?nèi)缬袆?chuàng)新的想法和意愿而實(shí)現(xiàn)條件又不足，就應(yīng)該與相關(guān)機(jī)構(gòu)、部門或個(gè)人協(xié)作，如科研機(jī)構(gòu)、大學(xué)、業(yè)內(nèi)專家、廠家企業(yè)等一切可用的力量，共同合作并分享成果。叢玉隆教授主張“產(chǎn)、學(xué)、研、用”聯(lián)合發(fā)展大檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，這也完全適用于創(chuàng)新發(fā)展檢驗(yàn)技術(shù)。

3.5 創(chuàng)新獨(dú)具中國特色的檢驗(yàn)技術(shù) 這是最具艱巨性的任務(wù)，最有挑戰(zhàn)性的夢想。記得數(shù)年前，在一次關(guān)于細(xì)菌耐藥性檢驗(yàn)的研討會中，筆者和陳民鈞教授感慨何時(shí)我們能有自己的藥物敏感試驗(yàn)折點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)。目前我國采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會的判定標(biāo)準(zhǔn)并非完全適合，因?yàn)槲覈牧餍懈腥揪辍⑴R床應(yīng)用抗菌藥物的品種和用量均與美國不完全相同，加之人種差異，迫切需要制定適合我國特點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。如果我們有組織地群策群力的完成這個(gè)任務(wù)，將是意義重大的創(chuàng)新。在此基礎(chǔ)上，筆者關(guān)于實(shí)現(xiàn)個(gè)體化藥物敏感試驗(yàn)報(bào)告的想法也就有了實(shí)現(xiàn)的基本條件［10］。

我國的微生物藥物敏感試驗(yàn)不能忽略中藥，對于中藥單藥的藥物敏感試驗(yàn)，前人做了許多嘗試。不久前，筆者看到中藥煎劑的顆粒劑的抑菌試驗(yàn)［11］，這使中藥藥物敏感試驗(yàn)的研究又前進(jìn)了一步，而其技術(shù)的完善和判定標(biāo)準(zhǔn)的制定仍需進(jìn)一步探索。當(dāng)然，需要我們創(chuàng)新的具有中國特色的項(xiàng)目絕非僅此兩例。

上述想法也是筆者的夢想。筆者如今已年逾八十，回顧一生從事微生物學(xué)檢驗(yàn)工作的歷程，憾事頗多。殷切希望寄于筆端，望能有益于讀者。

1 王金良.新傳染病的快速診斷要求發(fā)展微生物檢驗(yàn)新技術(shù).實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志.2009，1：2－5.

2 Long SW，Williams D，Valson C，etal.A genomic day in thelife of a clinical microbiology laboratory.J Clin Microbiol，2013，51：1272－1277.

3 Rifai N，Diamandis EP，Lo YM，etal.Advancinglaboratory medicine through innovation：a taleof six inventors.Clin Chem，2012，58：502－510.

4 劉端祺.一個(gè)細(xì)菌，多重啟迪.中國腫瘤臨床，2013，40：1－2.

5 朱慶義，宋亞軍，邵祝軍，等主編.軍團(tuán)菌和軍團(tuán)菌病.第1版.北京：科學(xué)出版社，2014.

6 叢玉隆，總主編.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué).第2版（下冊），北京：人民衛(wèi)生出版社，2014，921.

7 陳東科，孫長貴，主編.實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜.第1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010.

8 周庭銀，主編.臨床微生物診斷與圖解.第3版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2012.

9 Samuel L，Novak－Weekley S.Theroleof the clinical laboratory in the future of health care：lean microbiology.J Clin Microbiol，2014，52：1812－1817.

10 王金良.藥敏試驗(yàn)的更高目標(biāo)—個(gè)體化藥敏試驗(yàn)報(bào)告.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2012，35：764－765.

11 李迺文，譚俊青，王康春，等.5種中藥顆粒劑與水煎劑對5種耐藥菌株的體外抑菌作用比較.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，30：567－570.