三種主要食物過(guò)敏原蛋白及其結(jié)構(gòu)分析

張　楠，布冠好，陳復(fù)生，朱婷偉（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

三種主要食物過(guò)敏原蛋白及其結(jié)構(gòu)分析

張楠，布冠好*，陳復(fù)生，朱婷偉
（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州450001）

目前食物過(guò)敏已成為世界各地普遍存在的食品安全問(wèn)題，但引起人體過(guò)敏的大多是食物蛋白。本文主要綜述了大豆、花生、牛乳三種主要食物過(guò)敏蛋白及其結(jié)構(gòu)分析的研究進(jìn)展，為開(kāi)發(fā)低敏性食物制品提供依據(jù)。

食物過(guò)敏，蛋白結(jié)構(gòu)，分析方法

近年來(lái)，食物過(guò)敏已經(jīng)成為食品安全的主要問(wèn)題。調(diào)查顯示世界上約有4%的人口對(duì)食物過(guò)敏［1］，也有資料顯示在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，1%～2%的成人與5%～8%的兒童都存在食物過(guò)敏現(xiàn)象［2］。據(jù)報(bào)道顯示，已有160多種食物被確認(rèn)為具有過(guò)敏原性，其中牛乳、雞蛋、魚(yú)、甲殼類、花生、大豆、堅(jiān)果以及小麥?zhǔn)侵饕倪^(guò)敏原來(lái)源［3］。兒童主要對(duì)雞蛋和牛乳過(guò)敏［4］，而成人主要對(duì)海鮮類食物過(guò)敏［5］。很多食物在加工過(guò)程中會(huì)引起食物過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的改變而影響其過(guò)敏原性。因此，食物主要蛋白過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的研究越發(fā)重要。

目前，應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法眾多，但在通常的食物過(guò)敏蛋白結(jié)構(gòu)性能研究中，主要采用了包括紅外（IR）光譜、拉曼（Raman）光譜、圓二色譜（CD）、核磁共振（NMR）、電子顯微鏡（掃描電鏡SEM，透射電鏡）、示差掃描量熱法（DSC）、熱重分析（TGA）、動(dòng)態(tài)力學(xué)分析（DMA）等一系列技術(shù)手段［6］。盡管檢測(cè)食物過(guò)敏原結(jié)構(gòu)變化的方法眾多，但本文主要綜述了圓二色光譜法、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振、掃描電鏡、DSC法對(duì)大豆、花生、牛乳幾種主要過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)的研究。

1　大豆蛋白過(guò)敏原及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.1大豆主要蛋白過(guò)敏原

大豆中能引起人和動(dòng)物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)被稱為大豆抗原，也稱為致敏因子。主要包括：大豆空泡蛋白、大豆疏水蛋白、大豆殼蛋白、大豆抑制蛋白、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子等。其中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是主要的致敏蛋白。

1.1.1大豆球蛋白大豆球蛋白是由不同亞基構(gòu)成的六聚體蛋白，是11S球蛋白的主要成分，分子質(zhì)量為350～360ku，含有3000個(gè)氨基酸殘基，成熟的大豆球蛋白由非共價(jià)鍵連接的六個(gè)亞基對(duì)組成，每對(duì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量約60ku，由一個(gè)酸性A肽鏈（35～40ku）和一個(gè)堿性B肽鏈（22ku）通過(guò)二硫鍵連接而成。酸性亞基為A1、A2和A3，其等電點(diǎn)分別為pH5.15、5.40和4.75；堿性亞基主要為B1、B2和B3，它們的等電點(diǎn)分別是pH8.0、8.25和8.5［7］。在不同離子強(qiáng)度、不同的pH環(huán)境和不同熱處理?xiàng)l件下大豆球蛋白可解離為亞基、成分多肽和半分子形式，但是存在于天然狀態(tài)下的大豆球蛋白分子結(jié)構(gòu)卻十分緊密，很難被酶催化和水解［8］。

1.1.2β-伴大豆球蛋白β-伴大豆球蛋白現(xiàn)已被證實(shí)為一個(gè)三聚體蛋白，也稱7S蛋白，其分子質(zhì)量在150～200ku之間，該三聚體的聚集和解聚與溶液pH和離子強(qiáng)度密切相關(guān)，它由α、β、a’3個(gè)亞基組成，它們的相對(duì)分子質(zhì)量分別是67、50和71ku［9］。β-伴大豆球蛋白可在低溫條件下溶解，等電點(diǎn)pI分別為4.90、5.18、5.66～6.00［10］。目前，有研究將β-伴球蛋白的含量作為評(píng)價(jià)大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的指標(biāo)之一［11］。

1.2大豆主要過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析

大豆蛋白中常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要由α-螺旋方法，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲。研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)大豆過(guò)敏原二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化主要有CD色譜、紅外光譜、DSC、SEM等方法。目前有多人已對(duì)大豆及大豆制品復(fù)合物的結(jié)構(gòu)作出了相關(guān)研究。Marcone等［12］運(yùn)用CD色光譜測(cè)得大豆球蛋白的α-螺旋含量為16%，β-折疊含量為56%。Zhao等［13］通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）方法研究大豆中的7S和11S球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩種大豆球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，7S中β-折疊含量為45.6%，β-轉(zhuǎn)角為35.9%；11S中β-折疊含量為47.3%，β-轉(zhuǎn)角為35.8%，其中的α-螺旋則可以忽略。Zhang等［14］通過(guò)采用電泳、CD、紫外、DSC等方法研究了在高壓條件下的大豆球蛋白的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白會(huì)分解成亞單位，同時(shí)這些亞基的構(gòu)象經(jīng)過(guò)高壓加工已被改變。DSC結(jié)果分析表明，大豆球蛋白在400MPa的壓力下經(jīng)過(guò)10min處理后已變性；CD結(jié)果分析則表明，大豆球蛋白在500MPa的壓力下經(jīng)過(guò)10min處理后，一些α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的有序結(jié)構(gòu)被破壞從而變成無(wú)規(guī)卷曲。段春紅等［15］利用電泳、SEM、FTIR，分析了大豆7S球蛋白及其不同水解度的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征，F(xiàn)TIR的結(jié)果分析表明，7S球蛋白在酶法水解過(guò)程中各種構(gòu)象所占的比例發(fā)生了很大的變化，其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化。由于大豆過(guò)敏蛋白成分復(fù)雜，同時(shí)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白兩種主要致敏原組分會(huì)隨著外界環(huán)境條件的變化發(fā)生著解聚與再聚集，因此研究大豆蛋白構(gòu)象狀況及變化規(guī)律極其重要。另外，許彩虹［16］通過(guò)FTIR、CD、紫外等研究了大豆7S球蛋白糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，F(xiàn)TIR、CD的分析結(jié)果均表明，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-折疊有部分轉(zhuǎn)化為α-螺旋或無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)仍以β-結(jié)構(gòu)為主。紫外光譜掃描分析，蛋白質(zhì)在接入多糖鏈后，蛋白質(zhì)肽鏈會(huì)展開(kāi)，導(dǎo)致了一些位于分子內(nèi)部氨基酸的暴露，紫外強(qiáng)度增強(qiáng)。這些都為未來(lái)大豆過(guò)敏蛋白及其制品結(jié)構(gòu)的研究開(kāi)辟了道路。

2　花生蛋白過(guò)敏原及其結(jié)構(gòu)分析方法

2.1花生主要蛋白過(guò)敏原

花生中的過(guò)敏原主要是分子量在0.7～100ku之間的高度糖基化蛋白質(zhì)，它們來(lái)自于不同的蛋白質(zhì)家族［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，花生過(guò)敏原蛋白有Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7、Ara h8和某種脂蛋白9種蛋白成分，其中Ara h1、Ara h2、Ara h3被認(rèn)定為主要過(guò)敏原，它們可被90%以上對(duì)花生過(guò)敏的患者血清IgE所識(shí)別［18］。目前，對(duì)Ara h1、Ara h2、Ara h3這3種蛋白結(jié)構(gòu)研究較多。

2.1.1Ara h1Ara h1占花生蛋白總量的12%～16%，是花生過(guò)敏原中含量最高的過(guò)敏蛋白，是一種分子量為63.5ku，等電點(diǎn)為4.55的糖蛋白，在天然狀態(tài)下以三聚體形式存在［17］。其熱穩(wěn)定性強(qiáng)，耐酶解，不易消化，與豌豆蛋白的序列相似性為40%，是花生中致敏性較強(qiáng)的組分之一［19］。

2.1.2Ara h2Ara h2是一種含有172個(gè)氨基酸的蛋白，屬于2S白蛋白家族，分子量為17～20ku的同種異型蛋白，其pI值為5.2，占花生蛋白總量的10%左右［20］，也是花生蛋白的主要過(guò)敏原。

2.1.3Ara h3Ara h3是一種分子量為57ku的致敏糖蛋白，屬于cupin類型［17］，由氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)各有一個(gè)保守的cupin折疊，其中cupin折疊結(jié)構(gòu)是由2組反平行β折疊片、無(wú)規(guī)則環(huán)和1個(gè)α螺旋組成，Ara h3的62%～72%序列與大豆球蛋白相同［21］。

2.2結(jié)構(gòu)分析方法研究進(jìn)展

迄今為止，對(duì)花生主要過(guò)敏原蛋白及其糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的研究取得了較大進(jìn)展，使其結(jié)構(gòu)被更清楚地揭示。徐宏等［22］利用圓二色光譜和熒光光譜對(duì)花生蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)α螺旋的含量為45%，β折疊含量大于15%。胡純秋等［23］采用CD、ANS熒光探針結(jié)合紫外可見(jiàn)（UV-Vis）光譜等方法，在不同溫度和時(shí)間加熱花生過(guò)敏原Ara h2，CD色譜分析表明，Ara h2經(jīng)熱處理后其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其α-螺旋比例有所降低，而β-折疊比例均有所升高；紫外光譜顯示，處理溫度在55℃以上，包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的氨基酸殘基暴露出來(lái)，其紫外吸收值均升高。趙冠里［24］通過(guò)采用電泳、CD、紫外、DSC等方法研究花生過(guò)敏蛋白與多糖接枝后的構(gòu)象變化，DSC結(jié)果表明，蛋白糖接枝前的熱變性溫度低于接枝反應(yīng)產(chǎn)物的溫度；DC結(jié)果顯示，花生分離蛋白與葡聚糖的混合會(huì)引起花生蛋白中的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)略微的降低，而與此同時(shí)，花生蛋白中β-折疊所占二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例增加。另外，Liu等［25］利用電泳、CD、DSC等技術(shù)相結(jié)合研究了花生蛋白與葡聚糖糖基化后結(jié)構(gòu)的變化，CD結(jié)果表明，反應(yīng)過(guò)后花生蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，α-螺旋與無(wú)規(guī)卷曲數(shù)量減少，β-折疊比例增加，β-折疊無(wú)明顯變化。可見(jiàn)，花生過(guò)敏蛋白及加工過(guò)程結(jié)構(gòu)的研究已較完善，為今后深入研究其結(jié)構(gòu)，降低其抗原性提供基礎(chǔ)。

3　牛乳主要過(guò)敏原及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析

3.1牛乳主要蛋白過(guò)敏原結(jié)構(gòu)

牛乳過(guò)敏是由乳及乳制品中的蛋白過(guò)敏原所引發(fā)的一種變態(tài)反應(yīng)，它是由IgE介導(dǎo)或非IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，絕大多數(shù)的牛乳蛋白都具有潛在的致敏性，目前，普遍認(rèn)為酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白是3種主要的過(guò)敏原［26-27］。

3.1.1酪蛋白酪蛋白（casein）在牛乳中占蛋白質(zhì)總量的80%～82%，由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白4種獨(dú)立的蛋白組成，含有人體8種必需氨基酸，是一種全價(jià)蛋白質(zhì)（以酪蛋白膠束狀態(tài)存在，能夠?yàn)樯矬w生長(zhǎng)發(fā)育提供必需的氨基酸［28］。其中，αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一個(gè)過(guò)敏原蛋白，凡是對(duì)酪蛋白過(guò)敏的人，基本上會(huì)對(duì)αs1-酪蛋白過(guò)敏［29］。

3.1.2β-乳球蛋白β-乳球蛋白一般是二聚體，其每個(gè)單位為18ku，它是牛乳中主要乳清蛋白的成分，占乳清蛋白的50%，是牛乳中主要的致敏原，在體內(nèi)易引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，IgE介導(dǎo)的牛乳過(guò)敏病人大多對(duì)β-乳球蛋白過(guò)敏［30］。另外，β-乳球蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)需要一個(gè)完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)［31］。

3.1.3α-乳白蛋白α-乳白蛋白分子量為14ku，單體由123個(gè)氨基酸的球形蛋白組成，屬溶菌酶家族，占牛乳清蛋白的25%，含有4個(gè)二硫鍵，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。另外，在動(dòng)物模型中，α-乳白蛋白中成環(huán)的肽段（60～80），S-S（91～96）是最主要的抗原部位［31-32］。

3.2結(jié)構(gòu)分析研究

近幾十年來(lái)，隨著高新技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)在前人提出的理論基礎(chǔ)之上，多人對(duì)牛乳過(guò)敏蛋白及其加工后結(jié)構(gòu)的研究有了很大提高。楊同香等［33］利用Trp和ANS熒光質(zhì)譜技術(shù)對(duì)牛奶酪蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)低蛋白濃度對(duì)酪蛋白結(jié)構(gòu)的變化影響不明顯。Kim等［34］采用CD色譜法研究，將天然β-乳球蛋白在80℃的中性環(huán)境下加熱5min，α-螺旋從原來(lái)的16%降低到12%，不規(guī)則卷曲的含量從38%增加到43%，從而可看出該乳蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化很小。Navarra等［35］運(yùn)用FTIR技術(shù)研究了不同的金屬離子對(duì)β-乳球蛋白構(gòu)象的影響，結(jié)果顯示，在較低溫度下鋅離子能促進(jìn)β-乳球蛋白的聚合；同時(shí)銅離子的結(jié)合使β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Ashton等［36］運(yùn)用拉曼光譜法研究了不同pH對(duì)α-乳白蛋白的結(jié)構(gòu)影響，結(jié)果表明，當(dāng)pH為6.5～4.6時(shí)，主要是β-折疊發(fā)生了較大變化；而pH為3.6～1.8時(shí)，α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生了變化，同時(shí)，側(cè)鏈上暴露于溶劑中的氨基酸殘基也發(fā)生了變化。國(guó)內(nèi)研究方面，林花等［37］用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳研究牛血清白蛋白-葡聚糖的接枝改性，經(jīng)染色得到反應(yīng)體系生成了以共價(jià)結(jié)合的糖蛋白復(fù)合物，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。孫煒煒等［38］通過(guò)電泳、CD、紅外、SEM、內(nèi)源熒光分析乳清蛋白與葡聚糖接枝改性，從電泳圖譜得知，兩者確實(shí)發(fā)生了以共價(jià)鍵形式結(jié)合為基礎(chǔ)的接枝反應(yīng)，生成了分子量較大的物質(zhì)。由圓二色譜分析可知，接枝產(chǎn)物的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減少，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量增加。FTIR分析結(jié)果表明，糖分子的共價(jià)接入導(dǎo)致羥基和碳氧鍵的吸收峰強(qiáng)度增加；酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶峰形的變化進(jìn)一步說(shuō)明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞。SEM圖譜顯示，接枝物中并未出現(xiàn)典型的球狀結(jié)構(gòu)，而是以混亂的片狀結(jié)構(gòu)形式出現(xiàn)。仁珊等［39］利用美拉德反應(yīng)制備β-乳球蛋白與低聚異麥芽糖結(jié)合產(chǎn)物，并通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析得到結(jié)合物相對(duì)分子量為44ku，仍保持原有二聚體結(jié)構(gòu)。以上研究對(duì)進(jìn)一步探討牛乳蛋白結(jié)構(gòu)、抗原性、過(guò)敏原性具有重要的指導(dǎo)意義。

4　展望

隨著食品安全問(wèn)題日益成為廣大人民群眾關(guān)注的焦點(diǎn)，食物過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的研究變得越發(fā)重要。目前，有很多方法已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)食物過(guò)敏原加工后結(jié)構(gòu)的變化，但由于每種方法都存在一定的局限性，這就對(duì)過(guò)敏原結(jié)構(gòu)變化的研究提出了新的挑戰(zhàn)。同時(shí)，隨著各交叉學(xué)科的發(fā)展及研究的不斷深入，色光譜學(xué)技術(shù)與其他分析技術(shù)（如電泳、掃描電鏡）的聯(lián)用，在一定程度上促進(jìn)了過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)的研究。另外，在食物過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)的研究中，發(fā)現(xiàn)有較少研究將一些相關(guān)的免疫學(xué)性質(zhì)與過(guò)敏蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，因此這一方向?qū)?huì)成為今后重要的研究課題，為進(jìn)一步推動(dòng)食物過(guò)敏原蛋白結(jié)構(gòu)及其過(guò)敏原性降低的研究提供參考。

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Research on three major food allergens protein and its structures

ZHANG Nan，BU Guan-hao*，CHEN Fu-sheng，ZHU Ting-wei
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Food allergy had become a major safety issue concern worldwide，but human allergy mostly caused by food protein.The recent research progress on the structure of the major allergens in soybean，peanut，milk was focused in this paper.All of these information were useful on account of whey protein for producing hypoallergenic dairy products.

food allergy；protein structure；analysis

TS214.2

A

1002-0306（2015）02-0397-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.078

2014-05-12

張楠（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品蛋白質(zhì)資源開(kāi)發(fā)及利用。

布冠好（1980-），女，博士研究生，副教授，研究方向：食品蛋白質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與利用。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201293，21176058，31171790）；國(guó)家863項(xiàng)目（2013AA102208-5）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14B550013）。