軟骨損傷動(dòng)物模型的建立及分析方法

吳 寧 劉 武

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001）

軟骨損傷動(dòng)物模型的建立及分析方法

吳 寧 劉 武

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001）

目的：總結(jié)軟骨損傷動(dòng)物模型的建立及分析方法。方法：查閱軟骨損傷動(dòng)物模型的建立及分析方法的相關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果：軟骨損傷動(dòng)物模型的建立主要從動(dòng)物的選擇、損傷部位、損傷方法以及損傷后的軟骨分析等方面考慮，經(jīng)過分析得出最符合人類急性應(yīng)力損傷的造模方法，即撞擊法。結(jié)論：軟骨損傷動(dòng)物模型的建立及分析方法很多，效果及應(yīng)用各異。軟骨損傷動(dòng)物模型的損傷機(jī)制與人類之損傷機(jī)制越相似，治療及相關(guān)研究就越有價(jià)值。由于撞擊法模擬人類軟骨急性損傷機(jī)制，因此撞擊法建立軟骨損傷動(dòng)物模型備受重視。

軟骨損傷；動(dòng)物模型；方法

人體機(jī)能水平隨年齡增加呈拋物線樣改變，由于運(yùn)動(dòng)、勞累、負(fù)重以及關(guān)節(jié)長期過度體位負(fù)荷等因素，關(guān)節(jié)軟骨不可避免損傷退變。常見軟骨損傷不外乎慢性勞損退變及急性應(yīng)力損傷兩類。關(guān)節(jié)軟骨慢性勞損退變過程漫長，因素復(fù)雜，動(dòng)物研究困難，因此臨床常研究急性應(yīng)力導(dǎo)致的軟骨損傷。建立軟骨損傷動(dòng)物模型涉及動(dòng)物的選擇、損傷方法、關(guān)節(jié)部位、軟骨損傷分析等各個(gè)方面。本文將分別從這幾方面對(duì)軟骨損傷的動(dòng)物造模進(jìn)行綜述。

1 動(dòng)物的選擇

關(guān)于動(dòng)物軟骨損傷造模選擇的動(dòng)物有牛、狗、兔、鼠等。張勝等[1]用離體新鮮牛肩關(guān)節(jié)軟骨組織塊建立軟骨損傷模型研究撞擊應(yīng)力與軟骨損傷之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)從5 MPa 應(yīng)力開始,軟骨細(xì)胞死亡比例與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，應(yīng)力負(fù)荷引起關(guān)節(jié)軟骨的損傷與負(fù)荷加載速率有關(guān)，急性應(yīng)力負(fù)荷易損傷軟骨基質(zhì), 慢性應(yīng)力負(fù)荷易損傷軟骨細(xì)胞。陳琦等[2]用活體牛建立膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型進(jìn)行不同射頻能量處理研究，發(fā)現(xiàn)70W的雙極射頻能量處理即可使軟骨表面足夠光滑。Mrosek EH等[3]用狗膝關(guān)節(jié)建立軟骨損傷模型進(jìn)行免疫組化分析軟骨損傷，證實(shí)了軟骨下骨損傷可導(dǎo)致軟骨基質(zhì)退變，有學(xué)者運(yùn)用狗膝關(guān)節(jié)軟骨損傷模型研究骨軟骨變性[4]。胡炯等[5]選擇新西蘭兔建立關(guān)節(jié)軟骨病變的動(dòng)物模型。王東明等[6]選擇兔來建立鈍性軟骨挫傷模型，發(fā)現(xiàn)軟骨病變與時(shí)間、撞擊次數(shù)成正比關(guān)系。馬文明等[7]研究發(fā)現(xiàn)大鼠的前交叉韌帶切斷加內(nèi)側(cè)半月板切除10周后可出現(xiàn)軟骨損傷，選擇大鼠制作軟骨損傷模型可行。牛、狗、猴等費(fèi)用高，操作相對(duì)困難，實(shí)驗(yàn)適用度低，不宜用于普遍動(dòng)物模型研究；兔、鼠是目前普遍選用的動(dòng)物，適合各種模型研究。

2 造模部位

膝關(guān)節(jié)為重要的負(fù)重關(guān)節(jié)，此部位的軟骨損傷最為普遍，當(dāng)然也有髖關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究。王志巖等[8]選擇兔髖臼軟骨建立沖擊傷模型，并進(jìn)行沖擊能的量化研究，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量為0.4kg 的重錘從高 35cm處垂直開放性沖擊，軟骨所受總沖力平均值為 203.910N；從 15cm 處沖擊軟骨所受沖力平均值為105.919N。Newberry等[9]選擇兔膝關(guān)節(jié)通過閉合撞擊建立軟骨損傷模型，研究高能量及低能量撞擊下軟骨退變情況，發(fā)現(xiàn)撞擊力大，軟骨損傷程度重，膝關(guān)節(jié)退變也嚴(yán)重。Vrahas等[10]選擇兔股骨髁運(yùn)用自制沖擊器進(jìn)行開放性墜落撞擊法建立軟骨損傷模型，量化了沖擊能與軟骨損傷程度之間的關(guān)系。Mrosek等[3]選擇比格犬膝關(guān)節(jié)，運(yùn)用帶透視成像的自由墜落撞擊裝置閉合撞擊的方法建立軟骨損傷模型，通過免疫熒光檢驗(yàn)法分析了解損傷軟骨退變過程。其它關(guān)節(jié)的軟骨損傷比較少見，鮮有研究。

3 軟骨損傷造模方法

3.1 化學(xué)損傷造模方法

化學(xué)方法主要是通過關(guān)節(jié)腔藥物注射引起軟骨損傷。楊峰等[11]在兔顳頜關(guān)節(jié)上腔注射 0.3ml 1.6 %木瓜蛋白酶溶液，階段性切取關(guān)節(jié)軟骨做大體及組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨變薄、基質(zhì)分解破壞等退行性改變。Yeh等[12]在關(guān)節(jié)注射膠原酶后觀察發(fā)現(xiàn)用藥早期關(guān)節(jié)軟骨損傷破壞，晚期發(fā)生退變?？梢砸疖浌菗p傷的藥物還有碘乙酸鹽、透明質(zhì)酸酶、軟骨微粒、菲律賓菌素、腎上腺皮質(zhì)激素等，采用化學(xué)方法可用建立軟骨損傷退變動(dòng)物模型，但不能模擬急性應(yīng)力軟骨損傷。

3.2 物理損傷造模方法

人類急性應(yīng)力軟骨損傷常由碰撞引起，如高處落地引起骨與骨之間的碰撞，關(guān)節(jié)與外硬物的接觸碰撞等，軟骨損傷動(dòng)物模型的損傷機(jī)制與人類之損傷機(jī)制越相似，治療及相關(guān)研究就越有價(jià)值。軟骨損傷動(dòng)物模型中的物理損傷方法很多，梁佩紅等[13]用電動(dòng)骨鉆在兔股骨髁關(guān)節(jié)面部位造成直徑4.5mm，深度為3mm的關(guān)節(jié)軟骨缺損的單純手術(shù)鉆孔方法，建立了一個(gè)較理想的兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型。黎健偉等[14]用牙科鉆在兔膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面打造直徑4mm，深度約3mm的圓形孔，術(shù)后加伸直位固定12周，建立了膝關(guān)節(jié)陳舊性軟骨缺損模型。Mastbergen等[15]通過手術(shù)行不傷及軟骨下骨的軟骨表面刮痕建立犬軟骨損傷模型。此外，物理損傷方法有單純關(guān)節(jié)制動(dòng)[16]、手術(shù)切除關(guān)節(jié)韌帶等破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定性、血液循環(huán)阻礙、撞擊法等。邵世坤等[17]用擊錘直接開放性撞擊兔膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨面的方法致軟骨損傷，研究軟骨損傷后的退變過程，研究表明0.9J能量撞擊后軟骨早期Mankin評(píng)分與對(duì)照組有顯著性差異，4周后無差異性；6.3J能量撞擊后軟骨Mankin評(píng)分始終高于對(duì)照組，差異性隨時(shí)間逐漸增大。Mrosek等[3]通過閉合性撞擊犬膝關(guān)節(jié)建立軟骨損傷模型。撞擊法軟骨損傷即模擬人類損傷機(jī)制，因此撞擊法建立軟骨損傷動(dòng)物模型備受重視。

4 模型軟骨損傷的相關(guān)分析

4.1 損傷負(fù)荷的分析

撞擊法致軟骨損傷造模需要選擇合適的應(yīng)力負(fù)荷，負(fù)荷太小，無法損傷軟骨，或者僅造成輕微損傷，數(shù)日便可自愈；負(fù)荷太大，致使關(guān)節(jié)粉碎。不同動(dòng)物的軟骨所能承受的應(yīng)力負(fù)荷不同。Borrelli等[18]研究開放性撞擊牛軟骨損傷模型，證實(shí)25N/mm2（25Mpa）的沖擊力將引起軟骨細(xì)胞死亡；Thompson等[19]用 2170N 沖擊損傷犬髕股關(guān)節(jié)，發(fā)現(xiàn)軟骨下骨和鈣化帶有骨折移位，電鏡顯示關(guān)節(jié)面裂隙改變；Lahm等[20]研究發(fā)現(xiàn)犬髕股關(guān)節(jié)在1800N～2500N（平均大約2100N）的沖擊力下，可造成軟骨下骨損傷而不損傷關(guān)節(jié)軟骨面；邵世坤等[21]通過開放性墜落撞擊兔膝關(guān)節(jié)股骨滑車軟骨面，證實(shí)了6.3J能量撞擊可以造成膠原纖維網(wǎng)架斷裂及變形，軟骨外觀完整，此類損傷后關(guān)節(jié)軟骨不能自行修復(fù),并隨時(shí)間增加軟骨退變?cè)矫黠@；Ronsky等[22]通過壓力敏感性膠片試驗(yàn)顯示人關(guān)節(jié)的正常應(yīng)力在5-10MPa范圍內(nèi)。大鼠動(dòng)物軟骨所能承受的應(yīng)力負(fù)荷大小尚無研究，我們可以參考以上已有研究，通過各種應(yīng)力負(fù)荷損傷軟骨，或可摸索出不同動(dòng)物軟骨所能承受的應(yīng)力大小。

4.2 損傷后的組織學(xué)免疫學(xué)分析

如何知道不同的應(yīng)力下軟骨損傷的程度？常用方法是軟骨切片染色顯微觀察，損傷程度包括軟骨細(xì)胞損傷、軟骨有裂痕、膠原網(wǎng)架斷裂。研究發(fā)現(xiàn)此類程度損傷的軟骨不可自愈，并逐漸退變，損傷呈持續(xù)性加重[23]。衛(wèi)小春等[24]探討不同染色方法對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨染色的優(yōu)缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)番紅O染色顯示軟骨各層和潮線結(jié)構(gòu)最佳，蘇木精-伊紅染色觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)變化較其他染色方法清楚；張勝等[1]通過FDA/PI雙熒光染色法觀察軟骨細(xì)胞損傷的程度及分布模式，使用掃描電鏡觀察網(wǎng)狀膠原結(jié)構(gòu)以及采用改良的阿新藍(lán)染液法測定基質(zhì)損傷程度；姜鈴霞等[25]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物血清中BMP-2、CTX-Ⅱ、COMP 的含量能間接反映各期軟骨損傷的程度，軟骨切片行HE 染色后光鏡觀察，采用Mankin評(píng)分評(píng)估軟骨損傷程度；王東明等[6]選擇HE染色，番紅O染色，按Mankin評(píng)分法評(píng)分，II型膠原免疫組化檢測，II型膠原原位雜交，透射電鏡觀察等分析鈍性挫傷后兔關(guān)節(jié)軟骨的變化。組織學(xué)免疫學(xué)的主要觀察手段是通過各種化學(xué)染色及免疫雜交觀察組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性。我們通常運(yùn)用組織學(xué)方法觀察軟骨損傷程度，具體操作步驟：采集標(biāo)本→福爾馬林溶液固定→EDTA溶液脫鈣→脫水、浸蠟、包埋后切片→HE染色及番紅O染色等特殊染色→宏觀及顯微觀察。由于只有軟骨損傷致膠原網(wǎng)架斷裂才失去自愈能力[23]，所以我們可以通過觀察軟骨損傷程度選擇合適的沖擊力建立軟骨損傷動(dòng)物模型，反之，又可以研究不同的沖擊力對(duì)軟骨的損傷程度。

4.3 生物力學(xué)分析

研究表明由于關(guān)節(jié)軟骨本身的特性，軟骨損傷退變后，其生物力學(xué)會(huì)改變，原有的生物力學(xué)功能很難被修復(fù)，目前尚無很好的治療方法[26]。生物力學(xué)觀察內(nèi)容包括組織彈性及耐久性。傳統(tǒng)軟骨生物力學(xué)研究多集中在單細(xì)胞整體平均力學(xué)特性的分析上，其常用的研究方法如微管吸吮法[27]，無法在細(xì)胞自然生活狀態(tài)下進(jìn)行力學(xué)檢測，也不能提供細(xì)胞不同區(qū)域和部位更加精確的力學(xué)特性。劉廣源等[28]研究發(fā)現(xiàn)可以運(yùn)用原子力顯微術(shù)磁驅(qū)動(dòng)模式(MAC mode AFM)檢測細(xì)胞不同區(qū)域的彈性和粘滯性等力學(xué)特性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)法的不足。

4.4 軟骨損傷MRI分析

因MRI組織對(duì)比性強(qiáng)，空間分辨率高，可進(jìn)行多序列、多參數(shù)和多方位的采樣，在顯示軟骨組織方面，X線平片和CT是難以比擬的，臨床常用MRI輔助檢查患者關(guān)節(jié)軟骨情況。王志巖等[8]研究MRI影像學(xué)觀察沖擊傷后軟骨損傷程度，證實(shí)了MRI診斷早期軟骨損傷具有可行性，并與組織病理學(xué)進(jìn)行比較，認(rèn)為當(dāng)軟骨基質(zhì)、蛋白多糖和含水量的改變足以引起信號(hào)改變時(shí)，MRI 診斷軟骨損傷的敏感性和正確性與組織病理學(xué)一致，否則對(duì)軟骨損傷的分析判斷力不如組織病理學(xué)。Graichen等[29]研究表明 MRI 常規(guī)序列不能敏感和清晰的顯示關(guān)節(jié)軟骨，而王志巖的研究認(rèn)為T2*/C/RF-FAST/VOL和T2*/T/FE/MTC/MAST在軟骨損傷的診斷中，敏感度分別為 92%和 91%，特異度為 95%和 93%，應(yīng)作為關(guān)節(jié)軟骨檢查的最佳掃描序列；T1/C/FSE /C+造影序列在診斷軟骨損傷中，敏感度為 89%，特異度為 92%，可清晰顯示關(guān)節(jié)軟骨表面，尤其對(duì)軟骨缺損的診斷更為敏感。

5 結(jié)語

軟骨損傷動(dòng)物模型研究方法各有不同，但主線大同小異，一是選擇損傷方法；二是選擇損傷部位；三是對(duì)損傷部位進(jìn)行分析，篩選出模型；四是對(duì)模型進(jìn)行藥物研究，最后甚至可以進(jìn)行藥理機(jī)制研究。

通過軟骨損傷相關(guān)文獻(xiàn)了解，認(rèn)為撞擊法軟骨損傷最符合人類急性應(yīng)力損傷機(jī)制，鉆孔、刮痕、關(guān)節(jié)固定及藥物注射等方法所導(dǎo)致的軟骨損傷在人類軟骨損傷中較為少見。撞擊法中開放性直接撞擊雖然可以量化沖擊能與軟骨損傷程度之間的關(guān)系，但是手術(shù)損傷關(guān)節(jié)周圍組織結(jié)構(gòu)，疤痕組織或感染等影響關(guān)節(jié)活動(dòng)，由此方法建立的軟骨損傷動(dòng)物模型影響后期的關(guān)節(jié)退變及藥物治療研究，當(dāng)然，此方法可用于研究術(shù)后合并或造成軟骨損傷的患者。閉合性撞擊恰好可以避免開放性撞擊所造成的影響，且人類軟骨損傷也常是閉合性的。因此，若單純研究軟骨的即時(shí)損傷機(jī)制及量化沖擊能，選擇開放性撞擊法比較適宜；若合并研究軟骨損傷后軟骨退變及藥物治療情況，選擇閉合性撞擊法為佳。

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Methods to analysis and establish the animal model of articular cartilage injury

Objective:To review the methods to analysis and establish the animal model of articular cartilage injury. Methods:Recent literatures about the method of analyzing and establishing cartilage injury animal model were reviewed. Results:Methods to establish the animal model of cartilage damage mainly from aspects of animal selection, site of injury, means of injury and analysis of cartilage damage considering, the molding method of the most consistent with human acute stress damage, namely the impact method. Conclusion:A lot of methods to selection to analysis and establish the cartilage injury animal model ,which application and effect is different. Injury mechanism of human and injury mechanism of animal models of cartilage injury more similar, treatment and related research is more valuable. Because the impact method to simulate human acute osteochondral injury mechanism, thus it will be pay more and more attention to establish animal model of cartilage injury.

Cartilage injury; animal model; method

R-33

A

1008-1151(2015)01-0105-03

2014-12-15

吳寧（1986－），男，廣西玉林人，廣西中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)中醫(yī)骨傷專業(yè)碩士研究生，從事關(guān)節(jié)創(chuàng)傷及韌帶修復(fù)方向研究。