辣木外植體消毒試驗研究

姜 艷，高 燕，耿秀英，李澤生，李薇莎，姚 春

(云南省德宏熱帶農業(yè)科學研究所，云南瑞麗 678600)

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辣木外植體消毒試驗研究

姜 艷，高 燕*，耿秀英，李澤生，李薇莎，姚 春

(云南省德宏熱帶農業(yè)科學研究所，云南瑞麗 678600)

[目的] 探討辣木莖段的最佳消毒方法。[方法] 以辣木莖段為外植體，用不同消毒劑(升汞、次氯酸鈉)，選用不同濃度，在不同消毒時間下對辣木莖段進行消毒處理。[結果] 次氯酸鈉最佳消毒組合為濃度15 g/L消毒20 min，污染率為26%，成活率為34%。升汞最佳消毒組合為0.20 g/L消毒液消毒5 min，污染率為2%，成活率達84%。 [結論] 辣木莖段最佳消毒方法為：在75%酒精中浸泡30 s后，用0.20 g/L升汞處理5 min，污染率為2%，成活率達84%。

辣木；外植體；消毒

辣木樹(MoringaoleiferaLam.，英文名：Moringa tree)，又稱鼓槌樹、山葵樹，屬于辣木樹科，為多年生常綠小喬木至大喬木，現已知共有14種，供食用栽培的有印度辣木樹和非洲辣木樹2個品種。辣木全株都可利用，含有豐富的營養(yǎng)成分與抗營養(yǎng)成分[1-4]，礦物質和維生素含量也高于世界衛(wèi)生組織(WHO)的推薦攝取標準[5-6]。大量研究證明了辣木的醫(yī)療保健功能[7-13]。此外還含有人體必需的各種氨基酸和微量元素等，其營養(yǎng)價值與被稱為“人類營養(yǎng)微型寶庫”的螺旋藻相當。辣木樹作為蔬菜和食品有增進營養(yǎng)和食療保健功能，可用來增強免疫力，對艾滋病(AIDS)有一定的輔助治療作用，可以解決營養(yǎng)不良問題[5-6、14-16]，CWS(Church World Service)呼吁貧困地區(qū)將其作為主要營養(yǎng)食物。

隨著辣木各種用途及產品被人們所認識，在進入21世紀后作為一種新食品資源更加引起人們的重視[17]。辣木喜溫，耐干旱，生長快，非常適宜在云南省熱區(qū)推廣種植[18]。目前，種植辣木的地區(qū)越來越多，傳統(tǒng)的種子育苗已不能滿足市場需要。生產上種植的辣木有90%以上是采用種子育苗，存在性狀不穩(wěn)定、抗病差、產量低等問題，而以辣木莖段為外植體，通過組織培養(yǎng)生產辣木種苗，可保證品種的穩(wěn)定性、抗病性及品質，對促進云南辣木良種選育及種苗繁殖推廣具有重要意義。該研究通過比較多種消毒方法，旨在建立適于辣木外植體的消毒程序，為辣木快速繁殖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗材料為新抽發(fā)的辣木嫩莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理及清洗。剪取新抽發(fā)的辣木嫩枝，去除葉片，留帶腋芽的莖段，剪成4 cm左右長度，用自來水沖洗干凈備用。

1.2.2 外植體消毒滅菌。

(1)將清洗干凈的辣木莖段放入玻璃瓶中，在超凈工作臺中用75%酒精浸泡30 s左右。

(2)用鑷子取出后放入事先配制好的消毒劑中(消毒劑濃度及消毒時間見表1)，并不停地輕輕搖動，驅除氣泡，以促進材料各部分與消毒液充分接觸，消毒材料不宜放多，以保證消毒液充分浸泡辣木莖段，使消毒徹底；消毒時間為外植體加入消毒液開始計時，至取出外植體結束。

(3)在消毒結束前1 min，取出辣木莖段并將其放入無菌水中，搖動裝有無菌水和辣木莖段的瓶子30 s。

(4)取出辣木莖段并將其放入干凈的無菌水中，搖動瓶子30 s以上。如此重復5次，必須洗凈消毒劑。

表1 消毒劑濃度及滅菌時間

1.2.3 接種。將上述沖洗好的辣木莖段，按無菌操作要求將外植體切成一個節(jié)間、長1 cm左右莖段，接種于不定芽誘導培養(yǎng)基(添加一定濃度生長激素的MS培養(yǎng)基)上，每瓶接1個莖節(jié)，每個處理接種50瓶。經消毒處理好的外植體，必須切除原傷口，否則原傷口處被消毒劑傷害的細胞會對外植體后期生長產生影響。

1.2.4 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度為28 ℃，光照強度2 000 lx，光照時間10 h/d。

1.3 統(tǒng)計方法 培養(yǎng)3 d，開始觀察污染情況；培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計污染情況；培養(yǎng)21 d后，統(tǒng)計成活率和死亡褐化率。

污染率=(污染的外植體數/接種的外植體數)×100%

成活率=(成活的外植體數/接種的外植體數)×100%

死亡褐化率=(死亡褐化的外植體數/接種的外植體數)×100%

2 結果與分析

2.1 升汞對辣木外植體消毒滅菌的影響 培養(yǎng)3 d，觀察污染情況，HgCl2處理的莖段只有0.05 g/L濃度處理時有少量污染，5 d后0.10 g/L濃度處理的莖段也開始出現污染，在培養(yǎng)10 d統(tǒng)計污染情況時，發(fā)現滅菌時間為15 min的莖段已開始褐化甚至有死亡的現象。從圖1可以明顯看出，無論消毒滅菌時間多久，污染率都隨消毒時間增加而降低，而死亡褐化率都隨HgCl2濃度增加而增加；當滅菌時間為5 min時，成活率隨HgCl2濃度增加而升高，滅菌時間為10 min時，成活率先升高后降低，滅菌時間為15 min時，成活率呈下降趨勢。這樣的升降規(guī)律說明HgCl2消毒滅菌時間對于辣木莖段來說是至關重要的。

表2 不同消毒方法對辣木外植體影響

2.2 次氯酸鈉對辣木外植體消毒滅菌的影響 NaClO處理的莖段在3 d觀察污染時就已經大量污染了，但是培養(yǎng)10 d后仍然沒有發(fā)現褐化死亡。從表2可以看出，采用NaClO對辣木莖段進行消毒，消毒時間≤10 min的外植體污染率為100%；消毒時間≥15 min時，污染率隨著消毒時間的增加而降低，死亡褐化率和成活率隨濃度的增加而升高；消毒時間20 min、消毒液濃度為15 g/L時，效果最好，污染率為26%，成活率為34%，死亡褐化率為40%。

3 結論與討論

通過該試驗研究得出：以辣木莖段為外植體，先用75%酒精浸泡30 s后，再用0.20 g/L HgCl2消毒處理5 min效果最佳，污染率為2%，成活率高達84%，死亡褐化率為14%；其次是0.15 g/L HgCl2消毒處理5 min，污染率為10%，成活率高達78%，死亡褐化率為12%；NaClO處理效果最好的成活率僅40%。這就說明對于消毒滅菌而言，除了處理時間很關鍵以外，消毒劑的選擇也至關重要。該試驗選擇75%酒精浸泡30 s，利用酒精滲透壓吸收細菌的水分，殺死外植體表面細菌，再分別用HgCl2和NaClO處理，HgCl2中含有的重金屬離子可使含有巰基、氨基、二巰基、羥基等的酶受到損傷甚至失去活性，喪失功能，這2種方法互補不足，因此消毒效果顯著；而NaCLO則是利用其氧化作用消毒，僅能殺死外植體表面的少量細菌，效果跟75%酒精相似，將NaCLO與酒精組合，消毒效果欠佳。

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Research on Explants Disinfection Test ofMoringaoleiferaLam.

JIANG Yan, GAO Yan*, GENG Xiu-ying et al

(Dehong Institute of Tropical Agriculture, Ruili,Yunnan 678600)

[Objective] The aim was to explore the best method ofMoringaoleiferaLam. stem disinfection.[Method]WithM.oleiferaLam. stem as explant, the effects of different concentration of mercuric chloride and sodium hypochlorite with different sterilization time were studied. [Result] The best combination for NaClO was 15 g/L with 20 min disinfection, contamination rate was 26%, and survival rate was 40%. The best combination for HgCl2was 0.20 g/L with 5 min disinfection, contamination rate was 2%, survival rate could reach 84%.[Conclusion] The best method ofM.oleiferaLam. stem disinfection was that 75% alcohol immersion 30 s, after treated with 0.2 g/L mercuric chloride 5 min, contamination rate was only 2%, the survival rate could reach 84%.

MoringaoleiferaLam.; Explants; Disinfection

德宏州科技創(chuàng)新項目(2014-21)；德宏州生物產業(yè)辦項目。

姜艷(1983- )，女，貴州貴陽人，碩士，從事藥用植物選育種與組培快繁技術研究。*通訊作者，高級農藝師，從事藥用植物資源收集與種苗培育技術研究。

2015-04-21

S 723.1

A

0517-6611(2015)17-232-03