利用宏基因組技術(shù)發(fā)掘新木聚糖酶基因

羅 陽(yáng)，何 波，王佳堃，劉建新

(浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058)

利用宏基因組技術(shù)發(fā)掘新木聚糖酶基因

羅 陽(yáng)，何 波，王佳堃*，劉建新

(浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058)

木聚糖酶將日糧中的木聚糖降解成低聚糖。低聚糖及其厭氧發(fā)酵產(chǎn)物、短鏈脂肪酸可促進(jìn)消化道發(fā)育，維持消化道微生物穩(wěn)態(tài)。發(fā)掘新高效的木聚糖酶一直是酶工程研究的熱點(diǎn)。宏基因組技術(shù)為此研究提供了保障。BAC和Fosmid宏基因組文庫(kù)承載的信息量大，但陽(yáng)性克隆率低，加大了分析工作量。木聚糖酶功能域由保守區(qū)和可變區(qū)嵌合構(gòu)成，這為利用功能域基因研究木聚糖酶基因的多樣性及其與微生物菌群的關(guān)系提供了條件。為此，本文在總結(jié)純培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)歸納了BAC和Fosmid宏基因組文庫(kù)及木聚糖酶功能域基因文庫(kù)在發(fā)掘新木聚糖酶基因的應(yīng)用。

木聚糖酶基因;宏基因組技術(shù);純培養(yǎng)技術(shù)

木聚糖酶是一類(lèi)能將木聚糖水解為低聚木糖和木糖的復(fù)合酶,主要包括β-1,4內(nèi)切木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanase,E.C.3.2.1.8)、β-1,4外切木聚糖酶(β-1,4-D-extraxylanase,E.C 3.2.1.92)和β-木糖苷酶(β-xylosidase,E.C.3.2.1.37)等。依據(jù)底物特異性的不同,木聚糖酶可劃分為糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)5、7、8、10、11和43家族［1］,其中以GH10和GH11為主。木聚糖酶已廣泛應(yīng)用于飼料、造紙、食品和生物能源工業(yè)。由于2個(gè)家族都具有內(nèi)切功能,水解產(chǎn)物以低聚寡糖為主［2］,因此近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),木聚糖酶在促進(jìn)腸道微生物發(fā)酵,維持消化道結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。為此,發(fā)掘新型木聚糖酶基因再度成為研究熱點(diǎn)。

1 木聚糖酶基因的分布

木聚糖酶基因在自然界中分布廣泛,存在于細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌體內(nèi),主要以細(xì)菌門(mén)類(lèi)為主,真菌次之,如芽孢桿菌(Bacillus)［3-4］、放線菌(Actinoplanes)［5］、鏈霉菌(Streptomyces)［6］等。含有該基因的微生物在土壤、水體環(huán)境(包括海洋、江河、沼澤等)、半纖維素分解液(生活垃圾、工業(yè)發(fā)酵液)以及有機(jī)體的消化道內(nèi)均有分布,在自然界中扮演著“分解者”的角色。

動(dòng)物日糧中的半纖維素成分不能被自身分泌的酶類(lèi)降解,必須依靠微生物發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶水解成可吸收的成分［7］。發(fā)酵模式的差異直接影響到微生物的分布和功能。粗飼料是反芻動(dòng)物最主要的飼料來(lái)源,各種纖維物質(zhì)的降解是瘤胃中發(fā)生的最重要的消化過(guò)程。反芻動(dòng)物之所以能對(duì)纖維物質(zhì)具有利用優(yōu)勢(shì),主要依賴(lài)于棲息在瘤胃內(nèi)的大量具有纖維分解能力的微生物,因此瘤胃也成為纖維分解酶的主要發(fā)掘源。瘤胃內(nèi)能夠編碼木聚糖酶基因的微生物主要來(lái)自放線菌門(mén)(Actinobacteria)［8-10］、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)［11］、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)［12］和纖維桿菌門(mén)(Fibrobacteres)［13］。其中放線菌門(mén)代表菌種有鏈霉菌(Streptomyces);擬桿菌門(mén)主要集中于瘤胃普雷沃氏菌屬(Prevotella);厚壁菌門(mén)代表菌種有溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、黃色瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens)、 白色瘤胃球 菌(Ruminococcus albus)、溶纖維真細(xì)菌(Eubacterium cellulosolvens)、 反 芻 獸 真 細(xì) 菌 (Eubacterium ruminantium)等;產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes) 和 腸 道 絲 狀 桿 菌 (Fibrobacter intestinalis)是纖維桿菌門(mén)的主要成員。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的瘤胃木聚糖酶基因?qū)⒈缓Y選和定位。

2 木聚糖酶基因的發(fā)掘

目前針對(duì)木聚糖酶基因的研究方法很多,主要分為純培養(yǎng)技術(shù)和宏基因組技術(shù)。2種方法均成功發(fā)掘了上千種木聚糖酶基因,但各具優(yōu)勢(shì)的同時(shí),也各存局限。

2.1 純培養(yǎng)技術(shù) 純培養(yǎng)技術(shù)是從自然界中分離和研究微生物最傳統(tǒng)和直接的方法。隨著研究的深入,通過(guò)不斷地改善營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)環(huán)境,微生物的可培養(yǎng)性得到了提升。常見(jiàn)的培養(yǎng)策略有加富培養(yǎng)、混合培養(yǎng)、稀釋培養(yǎng)和模擬自然培養(yǎng)等。越來(lái)越多的微生物從菌群中分離開(kāi)來(lái),并用于科學(xué)研究。具體篩選流程:經(jīng)剛果紅或雷馬素亮藍(lán)R-D木聚糖(RBB)染色進(jìn)行功能篩選,分離得到具有水解木聚糖功能的純菌;提取基因組DNA并分析16sDNA序列,定位到微生物的種屬;然后對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序,找到編碼木聚糖酶的完整ORF(開(kāi)放閱讀框),或者經(jīng)過(guò)酶切(亞克隆文庫(kù))進(jìn)一步縮小該編碼基因的范圍,克隆出完整ORF,進(jìn)行異源表達(dá)或定向改造,目前,純培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)從曲霉屬真菌(Aspergillus)［14-16］、鏈霉菌屬(Streptomyces)［17］等微生物中成功發(fā)掘到新木聚糖酶基因。

雖然純培養(yǎng)技術(shù)一直是研究微生物的基石,但其單一的營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件還是與生境中微生物的多樣性和廣泛性的現(xiàn)實(shí)相違悖,導(dǎo)致極端環(huán)境中的微生物無(wú)法在人為模擬的環(huán)境下復(fù)蘇。例如,一些水生細(xì)菌離不開(kāi)藻類(lèi)分泌的生長(zhǎng)因子和維生素;動(dòng)植物病原菌對(duì)寄主活性物質(zhì)的依賴(lài)等都是傳統(tǒng)純培養(yǎng)法難以提供的。傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)技術(shù)評(píng)估不同生境微生物可培養(yǎng)性的分析結(jié)果顯示,海水中微生物的可培養(yǎng)性約為0.001%～0.1%,淡水約為0.25%,土壤約為0.3%,活性污泥為1%～15%［18］。由此可見(jiàn),純培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法完整地反映自然界中所有微生物的種群,成為限制其研究微生物木聚糖酶基因多樣性的一個(gè)瓶頸。

2.2 宏基因組技術(shù) 宏基因組技術(shù)改變了傳統(tǒng)純培養(yǎng)的理念,以生境中微生物的總DNA為研究對(duì)象,將其克隆到合適的載體,轉(zhuǎn)化到宿主菌中構(gòu)建BAC或Fosmid基因組文庫(kù)(圖1)。在發(fā)掘新基因和生物分子的前提下,利用生物信息學(xué)的方法,揭示基因之間、微生物之間、微生物與環(huán)境之間相互作用的規(guī)律,為微生物的研究拓展新的思路與方法,并從群落結(jié)構(gòu)水平上全面認(rèn)識(shí)微生物的生態(tài)特征和功能［19］。因此,宏基因組技術(shù)打破了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的壁壘,為生境中不可培養(yǎng)微生物的研究提供了可靠的技術(shù)保障。

圖 宏基因組學(xué)研究環(huán)境中新型基因流程示意圖

表1 BAC文庫(kù)和Fosmid文庫(kù)中篩選的木聚糖酶基因

2.2.1 利用BAC和Fosmid宏基因組文庫(kù) 宏基因組技術(shù)研究木聚糖酶基因的過(guò)程中,常構(gòu)建的文庫(kù)有BAC和Fosmid文庫(kù)(表1)。其區(qū)別在于插入目的基因片段的大小、構(gòu)建的載體和宿主等不同。BAC文庫(kù)所用的載體為CopyControl pCC1BAC,插入的DNA平均片段為100 kb;Fosmid文庫(kù)所用的載體為CopyControl pCC1FOSTM,插入的DNA平均片段為40 kb,因此BAC文庫(kù)能夠承載更多的微生物學(xué)信息,但Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建更為簡(jiǎn)單,而且文庫(kù)的信息量完全能滿足木聚糖酶基因研究的需要,因此在該領(lǐng)域,Fosmid文庫(kù)的應(yīng)用更為廣泛。

宏基因組文庫(kù)給木聚糖酶基因的研究提供保障,但文庫(kù)承載的信息量太大,庫(kù)容量從400 Mb～10 G不等,而且陽(yáng)性克隆率低,使得研究和分析工作量非常大。Xia等［20］構(gòu)建了奶牛瘤胃宏基因組BAC文庫(kù),6 000多個(gè)克隆中篩選到了25個(gè)具有糖基水解酶的陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性率為0.15%,包含GH5、GH8、GH9家族和纖維素酶的陽(yáng)性克隆。Eun等［21］以豬糞便堆肥為研究對(duì)象,構(gòu)建Fosmid文庫(kù),共獲得12 380個(gè)克隆,其中有5個(gè)具有木聚糖酶活性的陽(yáng)性克隆。Nimchua等［22］構(gòu)建了白蟻腸道微生物的Fosmid文庫(kù),獲得88 000個(gè)克隆,包括12個(gè)木聚糖酶和2個(gè)纖維素酶活性的陽(yáng)性克隆。王佳堃等［23］以瘤胃微生物為研究對(duì)象,構(gòu)建湖羊Fosmid文庫(kù),共獲得12 704個(gè)克隆,經(jīng)過(guò)剛果紅染色,篩選到了18個(gè)具有水解木聚糖酶的陽(yáng)性克隆,Yu等［24］利用同樣的方法構(gòu)建Fosmid文庫(kù),鳥(niǎo)槍法測(cè)序后獲得3553個(gè)ORF,分析得到34個(gè)水解纖維素和52個(gè)編碼木聚糖酶的克隆。

為了縮小新木聚糖酶基因的研究范圍,需要對(duì)宏基因組文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆建亞克隆文庫(kù)。亞克隆分析是基于鳥(niǎo)槍法(Shotgun Strategy)構(gòu)建外源DNA隨機(jī)片段的重組質(zhì)粒文庫(kù)。把大片段的外源DNA通過(guò)合適的限制性核酸內(nèi)切酶酶切或者采用機(jī)械性打斷方法,整合成小片段DNA(2～8 kb)連接到合適的載體上,轉(zhuǎn)化宿主菌中構(gòu)建外源DNA隨機(jī)片段重組質(zhì)粒文庫(kù)并篩選。通過(guò)這一過(guò)程的多次重復(fù),得到木聚糖酶基因的陽(yáng)性克隆,獲得編碼木聚糖酶的新基因。

2.2.2 木聚糖酶功能域基因文庫(kù) 木聚糖酶功能域由保守區(qū)和可變區(qū)嵌合構(gòu)成,這為利用功能域基因研究木聚糖基因的多樣性及其和微生物菌群的關(guān)系提供了條件。GH10家族蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的保守域由［W/Y］-D-W-D-V-［V/C/N］-N-E和［D/H］-［G/A/C］-［I/V/L］-G-［M/F/L/I］-Q-［S/G/M/C］-H［35］兩部分組成,兩個(gè)保守域之間嵌合了70個(gè)非保守氨基酸。GH11家族的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的兩個(gè)保守域?yàn)镾-Y-L-［C/S/ A］-［V/L］-Y-G-W和T-F-［V/L］-Q-［Y/F］-［W/F］-SV［36］,保守域之間有55個(gè)非保守氨基酸。Rose等［37］針對(duì)功能域兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并通用引物(X10-F和X10-R;X11-F和X11-R),Wang等［38-39］利用該引物構(gòu)建功能域基因文庫(kù),發(fā)現(xiàn)天山凍土層微生物和山羊瘤胃微生物中富含木聚糖酶基因,并結(jié)合基因步移法(genome walking)擴(kuò)增出全長(zhǎng)ORF,在原核生物中表達(dá)后可產(chǎn)生較高的酶活性。

全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增是依靠設(shè)計(jì)功能域遠(yuǎn)端引物、中間引物和近端引物,以及一個(gè)獨(dú)立設(shè)計(jì)、退火溫度較低的簡(jiǎn)并引物,進(jìn)行3次熱不對(duì)稱(chēng)巢式PCR(TAILPCR)反應(yīng)使目的片段由非特異性向特異性轉(zhuǎn)型,最終拼接得到全長(zhǎng)的木聚糖酶基因。Luo等［40］、Zhou等［41-44］等利用保守區(qū)引物擴(kuò)增功能域片段,結(jié)合基因步移法從鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.TN19)、鏈霉菌(Streptomyces sp.TN119)、耐酸嗜熱真菌(Bispora sp) 中獲得了新型木聚糖酶全長(zhǎng)基因χyl11B、XynA119、XynA19、χynB19、χynB119、和XynGR40。

3 小 結(jié)

新基因的發(fā)掘,一直是木聚糖酶研究領(lǐng)域的一個(gè)方向,不斷更新的生物技術(shù)為新木聚糖酶基因的研究提供了保障,尤其是二代測(cè)序技術(shù)的普及,使得木聚糖酶基因文庫(kù)的研究更加快速、豐富和準(zhǔn)確。而宏基因組技術(shù)在發(fā)掘更多新木聚糖酶基因的研究中發(fā)揮著不可替代的作用。因此,宏基因組技術(shù)與其它新的生物研究手段相結(jié)合,可以擴(kuò)大木聚糖酶基因的研究范圍,發(fā)掘到更多的新基因。

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Abstract:The oligosaccharides producted by xylanase from dietary hemicelluloses,and their microbial fermentation product,short-chain fatty acids,can promote growth of gut and maintain the balance of micro-environment.Therefore, development of new and efficient xylanase has been a hot research area in enzyme engineering.Metagenomic technology is a good tool for developing novel xylanase genes.There ismuchbiological information in the metagenomic library,such as BAC and fosmid,but thelow rate of positive cloningleads to a heavy analysis workload.The specific chimeric structure of full-lengthxylanase geneis consisted by conservative and variable domains.This provides opportunities to study diversity of xylanase genes and its relationship with microbiota.In this paper,we summarized the advantages and disadvantages of culture-dependent technology,and the application of BAC and fosmid metagenomic libraries and xylanase domains library in developing new xylanase gene.

Developing Novel Xylanase Genes with Metagenomic Technology

LUO Yang,HE Bo,WANG Jia-kun*,LIU Jian-xin
(The Research Institute of Dairy Science,ZhejiangUniversity,The Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition, Ministry of Education,Zhejiang Hangzhou 310058,China)

xylanase;metagenomics;culture-dependent techniques

S816.7

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:0258-7033(2015)11-0086-05

2014-10-23;

2014-12-15

科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2010DFA31040)

羅陽(yáng)(1988-),男,土家族,湖南張家界人,碩士研究生,從事木聚糖酶基因開(kāi)發(fā)的研究,E-mail:xinhelu509@163.com

*通訊作者:王佳堃,副教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:jiakunwang@zju.edu.cn