α-半乳糖苷酶對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體內(nèi)外消化率的影響

陳軼群，楊雯涵，郭曉晶，韓帥娟，楊勇智，曹云鶴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

α-半乳糖苷酶對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體內(nèi)外消化率的影響

陳軼群，楊雯涵，郭曉晶，韓帥娟，楊勇智，曹云鶴*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

本試驗(yàn)旨在探討日糧不同α-半乳糖苷酶添加水平對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響，并研究仿生酶法對(duì)酶制劑評(píng)價(jià)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)選用180頭生長(zhǎng)豬(杜×長(zhǎng)×大)，試驗(yàn)初始體重為(18.45± 2.00)kg，按照隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分為5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭豬(公、母各半)。日糧α-半乳糖苷酶添加量為0、100、200、300、400 U/kg，試驗(yàn)期為24 d。仿生酶法使用相同處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1根模擬消化管。結(jié)果表明:相對(duì)于其他處理組，添加300 U/kg α-半乳糖苷酶顯著提高了平均日采食量和平均日增重(P＜0.05);隨著-半乳糖苷酶添加量的增加，大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的體內(nèi)外消化率呈二次提高(P＜0.05);仿生酶法的消化率與體內(nèi)消化率高度相關(guān)。本試驗(yàn)證明，18～33 kg生長(zhǎng)豬的該-半乳糖苷酶最適宜添加水平為300 U/kg，且仿生酶法可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)體內(nèi)消化率，用于酶制劑的體外評(píng)價(jià)試驗(yàn)。

-半乳糖苷酶;豬;生產(chǎn)性能;消化率;仿生消化酶法

大豆和豆粕是單胃動(dòng)物飼料中使用最廣泛的植物性蛋白原料。然而,大豆及其加工產(chǎn)品中的寡糖,即大豆寡糖,包括蜜二糖、棉籽糖和水蘇糖,其抗?fàn)I養(yǎng)作用經(jīng)常被忽視［1］。后2種寡糖是在1個(gè)蔗糖的基礎(chǔ)上通過(guò)-1,6-糖苷鍵連接1個(gè)和2個(gè)-D-半乳糖而得到的［2］。豆粕中這3種糖的含量因大豆品種、產(chǎn)地和加工工藝等因素而略有不同,美國(guó)豆粕中蔗糖、棉籽糖和水蘇糖的平均含量分別約為65.8、11.8、49.8 g/kg干物質(zhì)［3］。這些寡糖在后腸段被微生物發(fā)酵后會(huì)引起脹氣和動(dòng)物不適,并降低其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率［4］。然而,物理或化學(xué)加工方法如加熱、浸泡、去皮和乙醇浸提不能完全消除大豆寡糖［5-7］。

因此,本試驗(yàn)使用畢赤酵母表達(dá)工程菌株進(jìn)行100 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后,制成-半乳糖苷酶樣品。旨在研究18～33 kg生長(zhǎng)豬玉米-豆粕型日糧中,添加-半乳糖苷酶對(duì)生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體內(nèi)外消化率的影響,以確定飼料中合適的添加量,并驗(yàn)證體外消化法對(duì)酶制劑評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 除特別注明者外,所有試劑均為分析純。本試驗(yàn)所使用的-半乳糖苷酶來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室分離的揚(yáng)奇青霉,經(jīng)畢赤酵母表達(dá)制得。發(fā)酵液于4℃,7 000 r/min離心5 min,上清液于4℃保存。酶樣品由發(fā)酵上清液吸附于細(xì)麩皮上,自然風(fēng)干制得。吸附后樣品酶活為400 U/g,酶活的測(cè)定方法參考Chen等［15］。其他材料參考楊雯涵等［16］體外消化試驗(yàn)測(cè)定方法。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和日糧 選取180頭初始體重為(18.45±2.00)kg的杜×長(zhǎng)×大三元雜交生長(zhǎng)豬,按照隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為5個(gè)處理,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù),每圈為1個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6頭豬,公、母各半,試驗(yàn)期為24 d?；A(chǔ)日糧配制參照NRC標(biāo)準(zhǔn),基礎(chǔ)日糧類(lèi)型為玉米-豆粕型日糧,5個(gè)處理分別在基礎(chǔ)日糧中添加終濃度為0、100、200、300、400 U/kg的-半乳糖苷酶。采用三氧化二鉻為指示劑。日糧配方和各處理營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。體外試驗(yàn)使用SDS-Ⅱ單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng),每個(gè)處理5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1根模擬消化管。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)在國(guó)家飼料工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心動(dòng)物試驗(yàn)基地(河北豐寧)進(jìn)行。試驗(yàn)用豬品種為杜×長(zhǎng)×大三元雜交。采用全進(jìn)全出飼養(yǎng)管理模式,豬舍溫度控制在18～20℃,自然光照。每圈(2.0 m×2.5 m)均配有1個(gè)乳頭式飲水器和1個(gè)料槽。圈舍為半水泥半漏縫地板,試驗(yàn)采用粉料飼喂,自由采食和飲水。按照豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行免疫和消毒。

1.4 體外消化率測(cè)定方法 參考楊雯涵等［16］的方法。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能與樣品采集 于試驗(yàn)0、12、24 d稱(chēng)豬和飼料重量,計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和耗料增重比(F∶G)。在試驗(yàn)的10～12 d和22～24 d,從每圈采集新鮮糞便,保存于-20℃,將3 d的糞樣混勻后,在60℃烘箱內(nèi)烘72 h至干燥。

1.5.2 日糧和糞便成分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率 試驗(yàn)日糧和糞樣取樣,粉碎過(guò)40目篩,參考AOAC方法測(cè)定飼料樣品與糞樣中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)和總磷(TP)含量。使用全自動(dòng)氧彈量熱儀(Parr 6300,美國(guó))測(cè)定飼料與糞中總能(GE)。用原子吸收分光光度法測(cè)定飼料與糞中鉻的含量(日立Z-2000原子吸收分光光度計(jì),日本)。

表 日糧配方與營(yíng)養(yǎng)成分

表 日糧配方與營(yíng)養(yǎng)成分

注∶①每千克飼料中由預(yù)混料提供∶維生素A 5 512 IU,維生素D32 200 IU,維生素E 30 IU,維生素K32.2 mg,維生素B1227.6 μg,維生素B24 mg,泛酸14 mg,煙酸30 mg,氯化膽堿400 mg,葉酸0.7 mg,維生素B11.5 mg,維生素 B63 mg,生物素 44 μg;錳(MnO)40 mg,鐵(FeSO4·H2O)75 mg,鋅(ZnO)75 mg,銅(CnSO4·5H2O)100 mg,碘(KI)0.3 mg,硒(Na2SeO3)0.3 mg。②除消化能外,其他值均為實(shí)測(cè)值

項(xiàng)目 α-半乳糖苷酶添加量/(U·kg-1) 0 100 200 300 400日糧組成/%玉米 67.04 67.04 67.04 67.04 67.04豆粕 25.40 25.40 25.40 25.40 25.40小麥麩 4.13 4.11 4.08 4.06 4.03石粉 0.87 0.87 0.87 0.87 0.87磷酸氫鈣 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10食鹽 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05氯化膽堿 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20肽生素 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01三氧化二鉻 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30預(yù)混料① 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50毒去完 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05酶樣 0.00 0.03 0.05 0.08 0.10合計(jì) 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00營(yíng)養(yǎng)成分②干物質(zhì)/% 88.21 87.38 87.30 87.57 87.32粗蛋白質(zhì)/% 18.25 18.54 18.51 18.27 18.61消化能/(MJ·kg-1) 14.21 14.21 14.21 14.21 14.21賴(lài)氨酸/% 0.95 0.98 0.97 0.98 0.96蛋氨酸/% 0.30 0.29 0.30 0.30 0.29蘇氨酸/% 0.70 0.73 0.70 0.75 0.71色氨酸/% 0.20 0.20 0.21 0.20 0.20鈣/% 0.70 0.73 0.72 0.69 0.68總磷/% 0.58 0.62 0.59 0.60 0.58 α-半乳糖苷酶活性/(U·kg-1) 0.6 95.3 198.6 287.2 389.6寡糖/(mg·g-1)蔗糖 5.57 5.56 5.53 5.57 5.52棉籽糖 0.65 0.66 0.65 0.64 0.65水蘇糖 1.42 1.43 1.42 1.41 1.44

日糧中氨基酸測(cè)定樣品粉碎過(guò)60目篩。在6 N鹽酸中,氮?dú)猸h(huán)境下110℃酸水解24 h,用氨基酸分析儀測(cè)定(日立L-8900,日本)。含硫氨基酸使用氧化水解方法測(cè)定。色氨酸經(jīng)過(guò)4 N氫氧化鋰堿水解,使用高效液相色譜測(cè)定(安捷倫1200,美國(guó))。

日糧中寡糖含量測(cè)定∶稱(chēng)取0.5 g樣品,先加入20 mL無(wú)水乙醇,振蕩混勻,接著加入30 mL 80%甲醇(v/v),磁力攪拌1 h。上清液8 000 r/min離心5 min,取1 mL定容于50 mL容量瓶中,0.22 μm濾膜過(guò)濾,用于離子色譜測(cè)定(戴安ICS-3000,美國(guó))。色譜分析采用250 mm×4 mm分析柱,使用120 mmol/L NaOH洗脫,流速為1.0 mL/min。

使用指示劑法測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(ATTD)。公式如下∶

ATTD(%)=［1-(NCfeces/NCdiet)×(Crdiet/Crfeces)］×100其中,NCfeces是糞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度(%),NCdiet是飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度(%),Crdiet是飼料中三氧化二鉻的濃度(%),Crfeces是糞中三氧化二鉻的濃度(%)。

體外消化率計(jì)算公式如下∶

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率(%)=100-(消化殘?jiān)亓俊料瘹堅(jiān)鼱I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量)/(試樣上樣重量×試樣營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量)×100

飼料酶水解物能值EHGE(MJ/kg)=(上樣飼料總能殘?jiān)偰?/上樣飼料干物質(zhì)量(g)/1000

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)以重復(fù)為統(tǒng)計(jì)單位,采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中GLM模型,以ANOVA方法進(jìn)行分析。采用線性及二次比較分析來(lái)評(píng)價(jià)梯度添加外源酶的作用效果。結(jié)果用最小二乘法的均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 日糧不同α-半乳糖苷酶添加量對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響 試驗(yàn)期間豬群總體健康狀況良好。由表2可知,當(dāng)添加量大于200 U/kg時(shí),12、24 d的體重顯著提高,添加量為300 U/kg時(shí)體重為最大值(P＜0.05)。此外,添加300 U/kg的α-半乳糖苷酶還可顯著提高1～12 d的平均日采食量(P＜0.05)和平均日增重(線性,P＜0.05),以及1～24 d的平均日采食量和平均日增重(P＜0.05);但添加不同水平的α-半乳糖苷酶對(duì)13～24 d的生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響。

2.2 日糧不同α-半乳糖苷酶添加量對(duì)生長(zhǎng)豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響 由表3可知,除了酸性洗滌纖維和鈣,日糧中添加100～300 U/kg的α-半乳糖苷酶均可顯著提高1～12 d其他常規(guī)指標(biāo)的消化率(線性,P＜0.05;二次,P＜0.05);但在13～24 d,只有200～300 U/kg的添加量可顯著提高除鈣以外其他指標(biāo)的消化率(二次,P＜0.05)。

表2 日糧不同α-半乳糖苷酶添加量對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響

表3 日糧不同α-半乳糖苷酶添加量對(duì)生長(zhǎng)豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響 %

2.4 體內(nèi)外消化率的相關(guān)性 從表5可以看出,能量、粗蛋白質(zhì)和中性洗滌纖維的體內(nèi)外消化率相關(guān)系數(shù)都在0.9以上(P＜0.05),表明2種測(cè)定方法上述指標(biāo)的相關(guān)性很高;且體內(nèi)能量消化率與干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和中性洗滌纖維的體外消化率高度相關(guān)。由體外消化率推測(cè)體內(nèi)消化率的方程見(jiàn)表6。

3 討 論

Gdala等［12］應(yīng)用瓣后盲腸T-型瘺管法、以體重約為20 kg的豬為研究研究對(duì)象,結(jié)果表明,各品種羽扇豆日糧中添加7 500 U/kg的-半乳糖苷酶均可提高約2%的回腸末端干物質(zhì)和能量消化率;蛋白質(zhì)的消化率變化不顯著,但大部分氨基酸的消化率提高了。43～94 kg生長(zhǎng)育肥豬日糧中添加200 U/kg的-半乳糖苷酶能顯著提高育肥期全消化道干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的消化率,并有提高中性洗滌纖維消化率的趨勢(shì)［2］。本試驗(yàn)中200～300 U/kg的添加量可顯著提高大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。由此可知,添加-半乳糖苷酶對(duì)日糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響受日糧類(lèi)型、豬的生長(zhǎng)階段及添加量等多種因素的制約。

表4 日糧不同α-半乳糖苷酶添加量對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體外消化率和能值的影響

表5 不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)體內(nèi)外消化率的相關(guān)性

表6 體內(nèi)消化率的預(yù)測(cè)方程 %

本試驗(yàn)中,日糧蔗糖、棉籽糖和水蘇糖的含量分別為5.57、0.65、1.42 mg/g,換算成豆粕中的含量約為21.93、2.56、5.59 mg/g,明顯低于報(bào)道中的含量(約59.2、10.6、44.8 mg/g)［3］,這可能是本試驗(yàn)僅添加300 U/kg的-半乳糖苷酶就對(duì)生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率提升較顯著的原因。日糧添加-半乳糖苷酶能顯著提高棉籽糖和水蘇糖的回腸末端消化率,但這2種糖在后端腸道中幾乎全部被微生物降解［12］,這與本試驗(yàn)的結(jié)果相同(數(shù)據(jù)未顯示)。因此,糞消化率不能反映日糧中大豆寡糖在小腸內(nèi)的降解情況,本試驗(yàn)-半乳糖苷酶的添加對(duì)日糧大豆寡糖的降解效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

陳亮［18］研究結(jié)果證明,仿生酶法測(cè)定的干物質(zhì)、能量和粗蛋白質(zhì)的消化率比體內(nèi)法低,干物質(zhì)、有機(jī)物、能量和粗蛋白質(zhì)的消化率與體內(nèi)消化率高度相關(guān),且能量和粗蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確性比體內(nèi)法更高,這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。李巖巖［19］用仿生酶法評(píng)價(jià)了小麥日糧添加木聚糖酶的效果,發(fā)現(xiàn)在酶的最高劑量時(shí)干物質(zhì)消化率最低,這與本研究高劑量酶呈現(xiàn)的消化率下降一致,可能是由于高濃度酶的反饋抑制造成的;同時(shí)只有干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的體外消化率與體內(nèi)法高度相關(guān),說(shuō)明體外法的準(zhǔn)確性受日糧組成的影響。

4 結(jié)論

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Effects of Dietary α-galactosidase on Performance of Growing Pigs and Nutrient Digestibility in vivo and in vitro

CHEN Yi-qun,YANG Wen-han,GUO Xiao-jing,HAN Shuai-juan,YANG Yong-zhi,CAO Yun-he*
(Ministry of Agriculture Feed Industry Centre,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

The objective of this study was to demonstratie the effects of-galactosidase supplementation on performance and nutrient digestibility in vivo and in vitro of growing pigs,and accuracy of simulative digestion method on enzyme evaluation trails.A total of 180 crossbred pigs(Duroc×Landrace×Large White),weighing 18.45±2.00 kg,were assigned to one of five treatments using a complete randomized block design.Each treatment contained six pens(three male pens and three female pens)with six pigs per pen.The experiment lasted for 24 days.A basal diet was formulated on the basis of corn and soybean meal and the other four experimental diets were identical to the basal diet with the exception that 100,200,300 or 400 U/kg of-galactosidase was included in these diets.The simulative digestion method used the same diets above with five replicates per treatment.Addition of 300 U/kg of-galactosidase increased average daily gain and average daily feed intake (P＜0.05),and nutrient digestibility both in vivo and in vitro showed a quadratic increase (P＜0.05)as increasing-galactosidase supplementation.Digestibility measured by simulative digestion was highly correlated with in vivo digestibility.It is concluded that 300 U/kg of-galactosidase would be optimum for growing pigs and simulative digestion method is potential for feed enzyme evaluation.

-galactosidase;pig;growth performance;nutrient digestibility;simulative digestion

S828.5

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:0258-7033(2015)11-0038-06

2014-09-16;

2014-11-02

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA022208);國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD10B01)

陳軼群(1985-),男,遼寧丹東人,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)博士

*通訊作者:曹云鶴,E-mail:Caoyh@can.edn.cn